조직학, 세포학 및 발생학의 연구 방법. 세포학 - 세포 과학 현대 연구 방법 연구에서 세포학의 주요 방법
조직학, 세포학 및 발생학의 발전을 위해서는 물리학 및 화학 분야의 성과 도입, 생화학, 분자 생물학, 유전 공학과 같은 관련 과학의 새로운 방법이 매우 중요합니다.
현대 연구 방법을 사용하면 조직을 단일 전체로 연구할 수 있을 뿐만 아니라 개별 세포 유형을 분리하여 장기간에 걸쳐 생명 활동을 연구하고 개별 세포 소기관과 구성 거대분자를 분리할 수 있습니다(예: DNA) 및 기능적 특성을 연구합니다.
다양한 유형의 현미경, 컴퓨터 기술, X선 구조 분석, 핵자기공명(NMR) 사용, 방사성 동위원소 및 방사선 사진 촬영, 전기 영동 및 크로마토그래피, 분별 등 새로운 도구 및 기술의 창출과 관련하여 이러한 기회가 열렸습니다. 초원심분리, 세포 분리 및 배양, 하이브리드 생산을 이용한 세포 내용물의 분석; 생명공학적 방법의 사용 - 하이브리도마 및 단일클론항체, 재조합 DNA 등의 생산
따라서 생물학적 대상은 조직, 세포, 세포 이하 및 분자 수준에서 연구될 수 있습니다. 세포 및 조직의 생명과 관련된 많은 문제를 해결하는 데 필요한 다양한 생화학적, 생물물리학적, 물리적 및 기술적 방법이 자연과학에 도입되었음에도 불구하고 조직학은 기본적으로 자체 방법 세트를 갖춘 형태학으로 남아 있습니다. 후자는 세포와 조직에서 발생하는 과정과 그 구조적 특징을 특성화하는 것을 가능하게 합니다.
세포학적 및 조직학적 분석의 주요 단계는 연구 대상 선택, 현미경 검사 준비, 현미경 방법 사용, 정성적 및 정량적 이미지 분석입니다.
연구 대상은 살아 있고 고정된 세포와 조직이며, 광학현미경과 전자현미경 또는 TV 디스플레이 화면에서 얻은 이미지입니다. 이러한 개체를 분석할 수 있는 방법에는 여러 가지가 있습니다.
조직학적 제제의 현미경 검사 방법
생물학적 미세 물체를 연구하는 주요 방법은 광학현미경과 전자현미경이며, 이는 실험 및 임상 실습에서 널리 사용됩니다.
현미경은 미세 물체를 연구하는 주요 방법으로 300년 이상 생물학에서 사용되었습니다. 최초의 현미경이 만들어지고 사용된 이후로 현미경은 지속적으로 개선되었습니다. 현대 현미경은 고해상도의 다양하고 복잡한 광학 시스템입니다. 현미경으로 볼 수 있는 가장 작은 구조의 크기는 주로 빛의 파장에 따라 달라지는 최소 분해 가능 거리(d o )에 의해 결정됩니다. (\) 및 전자 흐름의 전자기 진동의 파장 등. 이 의존성은 대략 다음 공식에 의해 결정됩니다. d 0 = 1 / 2 \. 따라서 파장이 짧을수록 분해 거리가 작아지고 프렙에서 미세 구조가 더 작아지는 것을 볼 수 있습니다. 조직학적 준비를 연구하기 위해 다양한 유형의 광학 현미경과 전자 현미경이 사용됩니다.
쌀. 1. 생물학 연구용 현미경.
A - 광학 생물학 현미경 "Biolam-S": 1 - 기본; 2 - 튜브 홀더; 3 - 경사 튜브; 4 - 접안 렌즈, 5 - 리볼버; 6 - 렌즈; 7 - 테이블; 8 - 아이리스 다이어프램이 있는 콘덴서; 9 - 콘덴서 나사; 10 - 거울; 11 - 마이크로미터 나사; 12 - 거시적 나사. B - 자동화된 이미지 처리 시스템을 갖춘 전자 현미경 EMV-100AK: 1 - 현미경 컬럼(전자 광학 시스템 및 샘플 챔버 포함); 2 - 제어판; 3 - 발광 스크린이 있는 카메라; 4 - 이미지 분석 장치; 5 - 비디오 신호 센서.
가벼운 현미경.조직학적 미세 물체를 연구하기 위해 다양한 파장의 광원을 사용하는 기존 광학 현미경과 그 종류가 사용됩니다. 기존 광학현미경에서 조명원은 자연광이나 인공광입니다(그림 1, A). 스펙트럼의 가시 부분의 최소 파장은 약 0.4μm입니다. 따라서 기존의 광학 현미경의 경우 가장 작은 분해능 거리는 약 0.2μm(하다 = "/,- 0.4 µm = 0.2 µm), 총 배율(대물렌즈 배율과 접안렌즈 배율의 곱)은 1500-2500이 될 수 있습니다.
따라서 광학 현미경에서는 크기가 4~150 마이크론인 개별 세포뿐만 아니라 세포 내 구조(소기관, 내포물)도 볼 수 있습니다. 미세 물체의 대비를 높이기 위해 색상이 사용됩니다.
자외선 현미경. 이것은 일종의 광학현미경이다. 자외선 현미경은 파장이 약 0.2 미크론인 더 짧은 자외선을 사용합니다. 여기서 분해된 거리는 기존 광학 현미경보다 2배 더 작으며 약 0.1μm(d o = V 2 - 0.2μm = 0.1μm)입니다. 자외선으로 얻은 눈에 보이지 않는 영상을 사진건판에 기록하거나 특수장치(형광판, 전자광학변환기)를 이용하여 가시영상으로 변환합니다.
형광(발광) 현미경.형광 현상은 단파 광선을 흡수하는 여러 물질의 원자와 분자가 여기 상태로 변한다는 사실로 구성됩니다. 여기 상태에서 정상 상태로의 역전이는 빛의 방출과 함께 발생하지만 파장이 더 길어집니다. 형광현미경에서는 초고압 수은 또는 크세논 램프를 광원으로 사용하여 형광을 자극하는데, 형광은 0.25~0.4μm(자외선 부근)과 0.4~0.5μm(청자외선)의 스펙트럼 영역에서 높은 밝기를 갖는다. ). 광선). 형광광의 파장은 항상 여기광의 파장보다 크기 때문에 광 필터를 사용하여 분리하고 형광광에서만 물체의 이미지를 연구합니다. 고유 형광(일차 형광)과 유도 형광(이차 형광)이 구별됩니다. 살아있는 유기체의 모든 세포는 자체 형광을 가지고 있지만 종종 극도로 약합니다.
1차 형광은 60-80°C의 포름알데히드 증기에 조직을 고정한 후 신경, 비만 및 기타 세포에 함유된 세로토닌, 카테콜아민(아드레날린, 노르아드레날린)에 의해 나타납니다(Falck 방법).
2차 형광은 약물이 특수 염료인 형광색소로 처리될 때 발생합니다.
특정 거대분자(아크리딘 오렌지, 로다민, 플루오레세인 등)에 특이적으로 결합하는 다양한 형광색소가 있습니다. 예를 들어, 아크리딘 오렌지 형광색소는 약물을 처리할 때 가장 자주 사용됩니다. 이 경우 세포 내 DNA와 그 화합물은 밝은 녹색을 띠며, RNA그리고 그 파생물 - 밝은 붉은 빛. 따라서 방사선의 스펙트럼 구성은 물체의 내부 구조와 화학적 구성에 대한 정보를 전달합니다. 스펙트럼의 자외선 영역에서 형광의 여기와 방출이 모두 발생하는 형광 현미경 방법의 변형을 방법이라고 합니다. 자외선 형광 현미경.
위상차 현미경.이 방법은 기존의 현미경 방법으로는 보이지 않는 투명하고 무색의 생물체의 대비 영상을 얻기 위해 사용됩니다. 이미 지적한 바와 같이, 기존의 광학 현미경에서는 염색을 통해 필요한 구조 대비를 얻을 수 있습니다. 위상 대비 방법은 콘덴서에 배치된 특수 환형 다이어프램과 렌즈에 위치한 소위 위상판으로 인해 연구된 도색되지 않은 구조에 대한 대비를 제공합니다. 이러한 현미경 광학 설계를 통해 눈으로 감지되지 않는 얼룩이 없는 표본을 통과하는 빛의 위상 변화를 진폭 변화로 변환할 수 있습니다. 결과 이미지의 밝기. 대비를 높이면 굴절률이 다른 모든 구조를 볼 수 있습니다. 위상차 방법의 변형은 다음과 같습니다. 위상-암시야 대비,음 대 양의 위상차 이미지를 제공합니다.
암시야 현미경.암시야 현미경에서는 표본의 구조를 회절시키는 빛만이 대물렌즈에 도달합니다. 이는 현미경에 특수 콘덴서가 존재하기 때문에 발생하며, 이는 엄격하게 경사진 빛으로 표본을 조명합니다. 조명기의 광선은 측면에서 나옵니다. 따라서 시야는 어둡게 나타나고 프렙의 작은 입자는 빛을 반사하여 렌즈로 들어갑니다. 이 현미경의 분해능은 동일한 파장을 사용하기 때문에 명시야 현미경의 분해능보다 나을 수 없습니다. 그러나 여기서는 더 큰 대조가 이루어집니다. 어두운 분야에서 밝게 나타나는 은알갱이와 같은 살아있는 물체, 자동 방사선 물체를 연구하는 데 사용됩니다. 임상에서는 소변의 결정(요산, 옥살산염)을 연구하고 스피로헤타, 특히 매독 등을 유발하는 트레포네마 팔리듐을 입증하는 데 사용됩니다.
간섭 현미경.위상차 현미경의 종류에는 조직 질량을 정량화하도록 설계된 간섭 현미경과 세포 및 기타 생물학적 물체의 표면 릴리프를 연구하는 데 특별히 사용되는 미분 간섭 현미경(Nomarski 광학 사용)이 있습니다.
간섭 현미경에서 조명기의 광선은 두 개의 흐름으로 나뉩니다. 하나는 물체를 통과하여 진동 위상을 변경하고, 두 번째 흐름은 물체를 우회합니다. 대물 프리즘에서는 두 광선이 모두 연결되어 서로 간섭합니다. 결과적으로 두께와 밀도가 다른 미세 물체의 단면이 대비 정도가 다른 이미지가 구성됩니다. 변화를 정량화한 후 건조물의 농도와 질량을 결정합니다.
위상차 및 간섭 현미경을 사용하면 살아있는 세포를 연구할 수 있습니다. 그들은 두 세트의 파동이 결합하여 미세 구조의 이미지를 생성할 때 발생하는 간섭 효과를 사용합니다. 위상차, 간섭 및 암시야 현미경의 장점은 이동 및 유사분열 과정에서 세포를 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 경우 시간 경과(프레임별) 마이크로필름을 사용하여 세포 움직임을 기록할 수 있습니다.
편광 현미경.편광 현미경은 두 개의 편광 필터가 설치된 광학 현미경의 변형입니다. 첫 번째(편광판)는 광선과 물체 사이에 있고 두 번째(분석기)는 대물 렌즈와 눈 사이에 있습니다. 첫 번째 필터를 통과하면 빛이 한 방향으로만 통과하고, 두 번째 필터는 주축이 첫 번째 필터와 수직을 이루며 빛을 투과시키지 않습니다. 이는 암시야 효과를 생성합니다. 두 필터 모두 회전하여 광선의 방향을 변경할 수 있습니다. 분석기가 편광판을 기준으로 90° 회전하면 빛이 편광판을 통과하지 못합니다. 세로 방향의 분자(콜라겐, 미세소관, 미세필라멘트)와 결정 구조(레이디히 세포 1)를 포함하는 구조는 회전축이 바뀔 때 빛나는 것으로 나타납니다. 광파를 일반 파동과 그에 수직인 파동으로 분할하는 결정 또는 준결정체 형성의 능력을 복굴절이라고 합니다. 줄무늬 근육의 원섬유에는 이러한 능력이 있습니다.
전자현미경.현미경 기술 개발의 큰 진전은 전자 현미경의 개발과 사용이었습니다(그림 1, B 참조). 전자현미경은 광학현미경보다 파장이 짧은 전자의 흐름을 사용합니다. 50,000V의 전압에서 진공에서 전자의 흐름이 이동할 때 발생하는 전자기 진동의 파장은 0.0056nm입니다. 이러한 조건에서 분해 거리는 약 0.002nm 또는 0.000002μm가 될 수 있다는 것이 이론적으로 계산됩니다. 100,000배 더 적습니다. 광학현미경으로 보는 것보다 실제로 현대 전자현미경에서 분해된 거리는 약 0.1~0.7nm입니다.
현재 투과(투과)전자현미경(TEM)과 주사(래스터)전자현미경(SEM)이 널리 사용되고 있다. TEM을 사용하면 연구 중인 미세 물체의 평면 이미지만 얻을 수 있습니다. 구조의 공간적 표현을 얻기 위해 3차원 이미지를 생성할 수 있는 SEM이 사용됩니다. 주사형 전자현미경은 연구 중인 물체를 전자현미경으로 주사하는 원리로 작동합니다. 즉, 예리하게 초점을 맞춘 전자빔을 사용하여 표면의 개별 지점을 순차적으로 "프로빙"합니다. 선택한 영역을 연구하기 위해 마이크로프로브는 편향 코일의 영향을 받아 표면을 따라 이동합니다(텔레비전 스캐닝 원리). 물체에 대한 이러한 연구를 스캐닝(판독)이라고 하며, 마이크로프로브가 움직이는 패턴을 래스터라고 합니다. 결과 이미지는 전자빔이 마이크로프로브와 동시에 이동하는 텔레비전 화면에 표시됩니다.
주사전자현미경의 주요 장점은 넓은 피사계 심도, 배율의 광범위한 연속 변화(수만에서 수만 배) 및 높은 해상도입니다.
냉동법을 이용한 전자현미경- 치핑막의 구조와 세포 간 연결의 세부 사항을 연구하는 데 사용됩니다. 칩을 만들기 위해 세포는 저온(-160°C)에서 동결됩니다. 막을 검사할 때 절단면은 지질 이중층의 중앙을 통과합니다. 다음으로, 생성된 멤브레인 반쪽의 내부 표면에 금속(백금, 팔라듐, 우라늄)을 분사하고 TEM 및 현미경 사진을 사용하여 연구합니다.
극저온전자현미경법.조직 샘플의 급속 냉동된 얇은 층(약 100nm)을 현미경 그리드 위에 놓고 -160°C의 진공 현미경에서 검사합니다.
전자현미경법 "동결"- 에칭"세포막의 외부 표면을 연구하는 데 사용됩니다. 세포를 매우 낮은 온도에서 급속 냉동시킨 후, 칼날로 블록을 쪼개는 방식입니다. 생성된 얼음 결정은 진공 상태에서 물을 승화시켜 제거됩니다. 그런 다음 중금속(예: 백금)의 얇은 필름을 스퍼터링하여 셀 영역을 음영 처리합니다. 이 방법을 사용하면 구조의 3차원 조직을 식별할 수 있습니다.
따라서 동결 절단 및 동결 에칭 방법을 사용하면 고정으로 인한 인공물 형성 없이 고정되지 않은 세포를 연구할 수 있습니다.
중금속 염과 대조되는 방법을 사용하면 전자 현미경으로 DNA, 큰 단백질(예: 미오신)과 같은 개별 거대분자를 검사할 수 있습니다. 음의 대비를 사용하여 거대분자(리보솜, 바이러스) 또는 단백질 필라멘트(액틴 필라멘트)의 집합체를 연구합니다.
극저온현미경절개술로 얻은 초박형 단면의 전자현미경.이 방법에서는 고체 매체에 고정되거나 매립되지 않은 조직 조각을 -196°C 온도의 액체 질소에서 빠르게 냉각합니다. 이는 세포 대사 과정의 억제와 액체상에서 고체상으로의 물의 전이를 보장합니다. 다음으로 초박절기를 사용하여 저온에서 블록을 절단합니다. 이 절편 준비 방법은 일반적으로 효소 활성을 결정하고 면역화학 반응을 수행하는 데 사용됩니다. 항원을 검출하기 위해 콜로이드 금 입자와 관련된 항체가 사용되며, 그 위치는 제제에서 쉽게 식별됩니다.
초고전압 현미경의 방법.최대 3,000,000V의 가속 전압을 갖는 전자 현미경이 사용됩니다. 이 현미경의 장점은 큰 두께(1-10 마이크론)의 물체를 연구할 수 있다는 것입니다. 높은 전자 에너지에서는 물체에 덜 흡수되기 때문입니다. . 입체 영상을 사용하면 고해상도(약 0.5 nm)로 세포 내 구조의 3차원 구성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.
X선 회절 분석.원자 수준에서 고분자의 구조를 연구하기 위해 약 0.1nm(수소 원자의 직경) 파장의 X선을 사용하는 방법이 사용됩니다. 결정 격자를 형성하는 분자는 다양한 강도의 많은 점 형태로 사진 판에 기록되는 회절 패턴을 사용하여 연구됩니다. 스폿의 강도는 어레이의 다양한 물체가 방사선을 산란시키는 능력에 따라 달라집니다. 회절 패턴에서 점의 위치는 시스템 내 물체의 위치에 따라 달라지며 그 강도는 내부 원자 구조를 나타냅니다.
고정된 세포 및 조직을 연구하는 방법
고정된 세포와 조직에 대한 연구.연구의 주요 목적은 조직학적 준비,고정된 구조로 준비되었습니다. 준비물은 도말(예: 혈액, 골수, 타액, 뇌척수액 등의 도말), 각인(예: 비장, 흉선, 간), 조직 막(예: 결합 또는 복막, 흉막, 유막), 얇은 조각. 대부분의 경우 조직이나 기관의 일부가 연구에 사용됩니다. 특별한 처리 없이 조직학적 준비를 연구할 수 있습니다. 예를 들어 준비된 혈액 도말, 인쇄물, 필름 또는 장기 절편을 현미경으로 즉시 검사할 수 있습니다. 그러나 구조의 대비가 낮기 때문에 기존 광학 현미경으로는 잘 보이지 않으며 특수 현미경(위상차 등)을 사용해야 하므로 특수 가공된 준비물을 사용하는 경우가 더 많습니다.
광학 및 전자 현미경 검사를 위한 조직학적 준비 과정에는 다음과 같은 주요 단계가 포함됩니다: 1) 재료 채취 및 고정, 2) 재료 압축, 3) 절편 준비, 4) 절편 염색 또는 대조. 광학 현미경 검사의 경우 섹션을 향유나 기타 투명 매체(5)에 넣는 또 다른 단계가 필요합니다. 정착분해 과정을 방지하여 구조의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 이는 기관에서 채취한 작은 샘플을 고정액(알코올, 포름알데히드, 중금속염 용액, 삼투산, 특수 고정액 혼합물)에 담그거나 열처리함으로써 달성됩니다. 고정액의 영향으로 조직과 기관에 복잡한 물리적, 화학적 변화가 발생합니다. 그 중 가장 중요한 것은 단백질의 돌이킬 수 없는 응고 과정으로, 그 결과 생명 활동이 중단되고 구조가 죽고 고정됩니다. 고정은 조각의 부피를 압축하고 감소시킬 뿐만 아니라 세포와 조직의 후속 착색을 개선합니다.
조각 압축절편제작에 꼭 필요한 제품으로 미리 탈수된 재료에 파라핀, 셀로이딘, 유기수지를 함침시켜 생산합니다. 예를 들어 액체 이산화탄소에서 조각을 동결시키는 방법을 사용하면 더 빠르게 압축할 수 있습니다.
섹션 준비특수 장치에서 생산 - 마이크로톰(광학 현미경용) 및 초박절편기(전자현미경용).
단면 염색(광학 현미경으로) 또는 금속염을 뿌린다.(전자 현미경에서)은 현미경으로 볼 때 개별 구조의 이미지 대비를 높이는 데 사용됩니다. 조직학적 구조를 염색하는 방법은 매우 다양하며 연구 목적에 따라 선택됩니다. 조직학적 염색은 산성, 염기성, 중성으로 구분됩니다. 예를 들어 핵 보라색을 염색하는 가장 유명한 기본 염료인 Azure II와 세포질을 분홍색-주황색으로 염색하는 산성 염료 에오신이 있습니다. 특정 염료에 대한 구조의 선택적 친화력은 화학적 조성과 물리적 특성에 따라 결정됩니다. 산성염료에 잘 염색되는 구조를 '산성염료'라 한다. 호산성(호산성, 호산성) 및 염기성 물질로 염색된 것 - 호염기성.산성염료와 염기성염료를 모두 수용하는 구조는 다음과 같다. 호중성(이성애성). 유색 제제는 일반적으로 강도가 증가하는 알코올에서 탈수되고 자일렌, 벤젠, 톨루엔 또는 일부 오일에서 제거됩니다. 장기간 보존을 위해 탈수된 조직 절편을 캐나다 발삼 또는 기타 물질로 된 슬라이드와 커버 글라스 사이에 밀봉합니다. 완성된 조직학적 표본은 수년간 현미경 연구에 사용될 수 있습니다. 전자현미경의 경우, 울트라마이크로톰으로 얻은 단면을 특수 그리드 위에 놓고 망간, 코발트 등의 염과 대조한 후 현미경으로 관찰하고 사진을 찍습니다. 생성된 현미경 사진은 조직학적 준비와 함께 연구 대상으로 사용됩니다.
살아있는 세포 및 조직을 연구하는 방법
살아있는 세포와 조직에 대한 연구를 통해 세포의 움직임, 분열, 파괴, 성장, 분화 및 상호 작용 과정, 수명주기 기간, 반응의 반응 변화를 추적하는 등 생명 활동에 대한 가장 완전한 정보를 얻을 수 있습니다. 다양한 요인의 작용에.
신체 세포의 생체내 연구(~에생체 내). 생체 내 연구 방법 중 하나는 살아있는 유기체의 구조를 관찰하는 것입니다. 예를 들어 특수 투과 조명 현미경을 사용하면 미세혈관의 혈액 순환 역학을 연구할 수 있습니다. 동물에게 마취제를 투여한 후 연구 대상(예: 장간막)을 꺼내 현미경으로 검사하는 한편, 조직은 등장성 염화나트륨 용액으로 지속적으로 적셔야 합니다. 그러나 그러한 관찰 기간은 제한되어 있습니다. 투명 카메라를 동물의 몸에 이식하는 방법이 가장 좋은 결과를 얻습니다.
이러한 카메라를 이식하고 후속 관찰을 하는 데 가장 편리한 기관은 동물(예: 토끼)의 귀입니다. 투명한 챔버가 있는 귀의 단면을 현미경 단계에 놓고 이러한 조건에서 세포와 조직의 변화 역학을 장기간에 걸쳐 연구합니다. 이러한 방식으로 혈관에서 백혈구를 제거하는 과정, 결합 조직, 모세 혈관, 신경 및 기타 과정 형성의 다양한 단계를 연구할 수 있습니다. 실험동물의 눈은 천연 투명 카메라로 활용될 수 있다. 세포, 조직 또는 장기 샘플은 각막과 홍채가 이루는 각도로 눈 앞방의 체액에 배치되며 투명한 각막을 통해 볼 수 있습니다. 이러한 방식으로 수정란을 이식하고 배아 발달의 초기 단계를 추적했습니다. 자궁의 작은 조각을 원숭이에게 이식하고 월경주기의 여러 단계에서 자궁 점막의 변화를 연구했습니다.
건강한 기증 동물의 혈액 세포와 골수를 치명적인 방사선에 노출된 수용 동물에게 이식하는 방법이 널리 사용되고 있습니다. 수혜 동물은 비장에서 조혈 세포의 콜로니를 형성하는 기증자 세포의 생착으로 인해 이식 후에도 살아 남았습니다. 콜로니의 수와 세포 구성을 연구하면 모 조혈 세포의 수와 다양한 분화 단계를 식별할 수 있습니다. 콜로니 형성 방법을 사용하여 모든 혈액 세포의 발생 원인을 확인했습니다.
필수 및 초생체 염색.세포와 조직의 생체(생명체 내) 염색에서는 염료가 동물의 몸에 도입되어 특정 세포, 세포 소기관 또는 세포간 물질을 선택적으로 염색합니다. 예를 들어, 트리판 블루나 리튬카르민을 사용하여 식세포를 검출하고, 알리자린을 사용하여 새로 형성된 골기질을 검출합니다.
초바이탈 염색은 신체에서 분리된 살아있는 세포를 염색하는 것입니다. 이러한 방식으로 혈액 망상적혈구(다이아몬드 크레실 블루 염료), 세포 내 미토콘드리아(야누스 녹색 염료), 리소좀(중성 적색 염료)과 같은 젊은 형태의 적혈구가 식별됩니다.
배양된 살아있는 세포와 조직에 대한 연구(~에시험관). 이 방법은 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 인간이나 동물의 신체에서 분리된 세포, 작은 조직 샘플 또는 장기는 혈장, 배아 추출물 및 인공 배지와 같은 특수 영양 배지가 들어 있는 유리 또는 플라스틱 용기에 넣습니다. 현탁 배양(배지에 떠 있는 세포), 조직, 기관 및 단층 배양(외식된 세포가 유리 위에 연속적인 층을 형성함)이 있습니다. 환경의 무균 상태와 체온에 상응하는 온도가 보장됩니다. 이러한 조건에서 세포는 오랫동안 기본 활력 징후, 즉 성장, 번식, 분화 및 이동 능력을 유지합니다. 배양 배지를 업데이트하고 생존 가능한 세포를 다른 혈관에 이식하면 이러한 배양은 며칠, 몇 달, 심지어 몇 년 동안 지속될 수 있습니다. 일부 유형의 세포는 게놈의 변화로 인해 배양 중에 생존하고 증식하여 연속적인 세포주를 형성할 수 있습니다. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky, F. M. Lazarenko는 세포 및 조직 배양 방법 개발에 큰 공헌을했습니다. 현재, 섬유아세포, 근육세포, 상피세포, 대식세포 등의 세포주가 얻어졌으며, 이는 수년 동안 존재해왔다.
배양 방법을 사용하면 다양한 분화 패턴, 세포의 악성 변성, 세포 상호 작용, 세포와 바이러스 및 미생물의 상호 작용을 확인할 수 있었습니다. 배양에서 세포간 물질을 형성하는 연골 세포의 능력과 호르몬을 생산하는 부신 세포의 능력이 입증되었습니다. 배아 조직과 기관의 배양을 통해 뼈, 피부 및 기타 기관의 발달을 추적하는 것이 가능해졌습니다. 신경세포를 배양하는 기술이 개발됐다.
조직 배양 방법은 인간 세포와 조직에 대한 실험적 관찰을 수행하는 데 특히 중요합니다. 천자 또는 생검 중에 인체에서 채취한 세포를 조직 배양에 사용하여 성별, 유전병, 악성 변성을 확인하고 다양한 독성 물질의 영향을 감지할 수 있습니다.
최근에는 세포 교배를 위해 세포 배양이 널리 사용되고 있습니다.
조직을 세포로 나누고, 개별 세포 유형을 분리하고 배양하는 방법이 개발되었습니다.
먼저, 단백질 분해 효소(트립신, 콜라게나제) 및 Ca 2+ 결합 화합물(EDTA - 에틸렌디아민테트라아세트산 사용)을 사용하여 세포간 접촉 및 세포간 기질을 파괴하여 조직을 세포 현탁액으로 변환합니다. 다음으로, 생성된 현탁액은 원심분리를 사용하여 다양한 유형의 세포 분획으로 나누어집니다. 이를 통해 무거운 세포를 가벼운 세포와, 큰 세포와 작은 세포를 분리하거나 세포를 유리나 플라스틱에 부착하여 분리할 수 있습니다. 다양한 유형의 세포. 유리 표면에 세포의 특정 접착을 보장하기 위해 한 유형의 세포에 특이적으로 결합하는 항체가 사용됩니다. 그런 다음 부착 세포는 효소로 기질을 파괴하여 분리되어 균질한 세포가 현탁됩니다. 세포 분리의 보다 미묘한 방법은 형광 염료와 관련된 항체로 라벨링하는 것입니다. 표지된 세포는 분류기(전자 형광 활성화 세포 분석기)를 사용하여 표지되지 않은 세포와 분리됩니다. 세포 분석기는 1회에 약 5000개의 세포를 분류합니다. 분리된 세포는 배양 조건에서 연구될 수 있습니다.
세포를 배양하는 방법을 통해 세포의 생명활동, 생식, 분화, 다른 세포와의 상호작용, 호르몬의 영향, 성장인자 등을 연구할 수 있습니다.
배양은 일반적으로 위에서 설명한 조직 해리 방법으로 얻은 세포 현탁액으로부터 준비됩니다. 대부분의 세포는 현탁액에서 성장할 수 없으며 때로는 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분이 있는 플라스틱 배양 접시의 표면인 단단한 표면이 필요합니다. 주요 작물세포 분획의 첫 번째 단계 직후에 준비된 배양균을 말합니다. 반성- 일차 배양에서 새로운 환경으로 이식된 세포 배양. 세포는 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 연속적으로 이식될 수 있으며, 세포는 분화의 특징적인 특징(예를 들어, 층을 형성하는 상피 세포)을 유지합니다. 세포 배양의 출발 물질은 일반적으로 태아 및 신생아 조직입니다.
영양배지로는 염분, 아미노산, 비타민, 말혈청, 닭배아추출물, 태아혈청 등의 혼합물이 사용되며, 다양한 종류의 세포를 배양하기 위한 특수배지가 개발되었습니다. 여기에는 세포가 기능하고 재생산하는 데 필요한 하나 이상의 단백질 성장 인자가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 신경 성장 인자(NGF)는 신경 세포의 성장에 필요합니다.
배양된 대부분의 세포는 특정 수의 분열(50-100)을 거친 후 죽습니다. 때때로 돌연변이 세포가 배양물에 나타나며 끝없이 증식하여 세포주(섬유아세포, 상피세포, 근아세포 등)를 형성합니다. 돌연변이 세포는 지속적인 분열이 가능하지만 단단한 표면에 부착되지 않고 성장할 수 있는 암세포와 다릅니다. 배양 접시의 암세포는 정상 세포 집단보다 밀도가 높은 집단을 형성합니다. 유사한 특성은 정상 세포를 종양 유래 바이러스 또는 화학적 화합물로 형질전환시켜 종양성 형질전환 세포주를 형성함으로써 실험적으로 유도할 수 있습니다. 비형질전환 세포와 형질전환 세포의 세포주는 저온(-70℃)에서 장기간 보관이 가능하다. 세포의 유전적 균질성은 순차적 분열 중에 하나의 세포에서 균질한 세포의 큰 콜로니를 얻는 복제를 통해 향상됩니다. 클론은 단일 전구 세포에서 파생된 세포 집단입니다.
세포 잡종.서로 다른 유형의 두 세포가 합쳐지면 두 개의 핵을 가진 세포인 이핵핵이 형성됩니다. 이핵핵을 얻기 위해 세포 현탁액을 폴리에틸렌 글리콜 또는 불활성화된 바이러스로 처리하여 세포의 원형질막을 손상시킨 후 세포가 융합할 수 있게 됩니다. 예를 들어, 닭 적혈구의 비활성 핵은 세포 융합 시 활성화되고(RNA 합성, DNA 복제) 조직 배양에서 성장하는 다른 세포의 세포질로 전달됩니다. 이핵핵은 유사분열이 가능하여 다음을 형성합니다. 하이브리드 셀.이핵핵의 핵 껍질은 파괴되고 염색체는 하나의 큰 핵으로 결합됩니다.
하이브리드 세포의 클로닝은 게놈 연구에 사용되는 하이브리드 세포주를 형성합니다. 예를 들어, 마우스-인간 하이브리드 세포주에서는 인슐린 합성에서 인간 염색체 11번의 역할이 확립되었습니다.
하이브리도마.하이브리도마 세포주는 단클론 항체를 생산하는 데 사용됩니다. 항체는 예방접종 중에 B 림프구에서 형성되는 형질세포에 의해 생성됩니다. 특정 유형의 항체는 특정 항원으로 마우스를 면역화하여 얻습니다. 이렇게 면역화된 림프구를 클로닝하면 균질한 항체를 대량으로 얻을 수 있다. 그러나 배양에서 B 림프구의 수명은 제한되어 있습니다. 따라서 그들은 "불멸의" 종양 세포(B-림프종)와 합쳐집니다. 결과적으로 하이브리드가 형성됩니다. (하이브리드 셀,두 개의 서로 다른 세포의 게놈을 사용합니다. 오마 -종양의 이름으로 끝남). 이러한 하이브리도마는 배양 중에 장기간 증식이 가능하고 특정 유형의 항체를 합성할 수 있습니다. 각 하이브리도마 클론은 단클론 항체의 원천입니다. 특정 유형의 모든 항체 분자는 동일한 항원 결합 특이성을 갖습니다. 세포에 포함된 모든 단백질에 대한 단클론 항체를 얻고 이를 사용하여 세포 내 단백질의 위치를 확인하고 혼합물에서 단백질을 분리(단백질 정제)하여 구조와 기능을 연구할 수 있습니다. 단백질의. 단일클론 항체는 유전자 복제 기술에도 사용됩니다.
항체는 얇은 유리 피펫을 사용하여 혈장을 통해 세포의 세포질에 직접 도입하여 다양한 분자의 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 수정된 성게 알의 세포질에 미오신에 대한 항체를 도입하면 세포질 분열이 중단됩니다.
재조합 DNA 기술.고전적인 유전적 방법을 사용하면 돌연변이 유기체와 그 자손의 표현형을 분석하여 유전자 기능을 연구할 수 있습니다. 재조합 DNA 기술은 이러한 방법을 보완하여 유전 물질의 상세한 화학적 분석과 세포 단백질의 대량 생산을 가능하게 합니다.
혼성화 방법은 현대 생물학에서 유전자의 구조와 발현을 연구하기 위해 널리 사용됩니다.
세포와 조직의 화학적 조성과 대사를 연구하는 방법
생물학적 구조의 화학적 구성, 즉 물질의 국소화, 대사 과정에서의 농도 및 역학을 연구하기 위해 특별한 연구 방법이 사용됩니다.
사이토-그리고 조직화학적 방법.이러한 방법을 사용하면 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 지질, 아미노산, 미네랄, 비타민, 효소 활성 등 세포, 조직 및 기관의 구조에서 다양한 화학 물질의 위치를 확인할 수 있습니다. 이러한 방법은 화학 시약과 세포 및 조직 구조의 일부인 기질 사이의 반응 특이성과 화학 반응 생성물의 착색을 기반으로 합니다. 반응의 특이성을 높이기 위해 효소 조절이 종종 사용됩니다. 예를 들어, 세포에서 리보핵산(RNA)을 검출하기 위해 갈로시아닌이 종종 사용되는데, 기본 특성을 지닌 염료이며, RNA RNA를 절단하는 리보뉴클레아제로 대조 처리하여 확인했습니다. 갈로시아닌 얼룩 RNA청자색. 절편을 리보뉴클레아제로 전처리한 다음 갈로시아닌으로 염색한 경우, 염색이 없으면 구조에 리보핵산이 존재한다는 것을 확인합니다. 다양한 세포화학적 방법과 조직화학적 방법에 대한 설명은 특별 매뉴얼에 나와 있습니다.
최근 몇 년 동안 조직화학적 방법과 전자현미경의 결합으로 전자 조직화학이라는 새로운 유망한 방향이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 세포뿐만 아니라 세포 이하 및 분자 수준에서도 다양한 화학물질의 위치를 연구할 수 있습니다.
세포의 거대분자를 연구하기 위해서는 방사성 동위원소와 항체를 사용하는 매우 민감한 방법이 사용되는데, 이를 통해 적은 양(1000개 미만)의 분자라도 검출이 가능합니다.
방사성 동위원소핵이 붕괴되면 핵은 하전 입자(전자) 또는 방사선(예: 감마선)을 방출하며, 이는 특수 기기에서 감지할 수 있습니다. 방사성 동위원소는 자가방사선 촬영법에 사용됩니다. 예를 들어, 3 H-티미딘의 방사성 동위원소의 도움으로 핵의 DNA가 3 H-우리딘 - RNA의 도움으로 연구됩니다.
자동 방사선 촬영 방법.이 방법을 사용하면 다양한 구조의 대사를 가장 완벽하게 연구할 수 있습니다. 이 방법은 방사성 원소(예: 인 - 32 P, 탄소 - 14 C, 황 - 35 S, 수소 - 3 H) 또는 이들로 표시된 화합물의 사용을 기반으로 합니다. 조직학적 절편의 방사성 물질은 사진 유제를 사용하여 검출되며, 이를 제제에 적용한 후 현상합니다. 광유제가 방사성 물질과 접촉하는 약물 영역에서는 광반응이 일어나서 조명 영역(트랙)이 형성됩니다. 이 방법은 예를 들어 표지된 아미노산이 단백질에 결합되는 속도, 핵산 형성, 갑상선 세포의 요오드 대사 등을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
면역형광 분석 방법. 항체의 적용.항체는 이물질(항원)의 작용에 반응하여 형질 세포(B 림프구의 파생물)에서 생성되는 보호 단백질입니다. 다양한 형태의 항체의 수는 백만 개에 이릅니다. 각 항체에는 이 항체의 합성을 일으킨 분자를 "인식"하는 부위가 있습니다. 항원에 대한 항체의 특이성이 높기 때문에 모든 세포 단백질을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 단백질의 위치를 밝히기 위해 항체를 형광 염료로 염색한 다음 형광 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다. 항체는 전자현미경을 사용하여 미세구조 수준에서 항원을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이를 위해 항체에는 전자 밀도가 높은 입자(콜로이드 금 미소구체)가 표시되어 있습니다. 반응의 특이성을 높이기 위해 단일 세포에서 하이브리도마 방법으로 얻은 클론 인 세포주에 의해 형성된 단일 클론 항체가 사용됩니다. 하이브리도마 방법을 사용하면 동일한 특이성을 갖고 무제한 수량으로 단일클론 항체를 얻을 수 있습니다.
면역형광 분석 방법은 현대 조직학에서 광범위하고 효과적으로 사용됩니다. 이러한 방법은 세포 분화 과정을 연구하고 그 안의 특정 화학 화합물과 구조를 식별하는 데 사용됩니다. 이는 항원-항체 반응을 기반으로 합니다. 신체의 각 세포는 주로 단백질에 의해 결정되는 특정 항원 구성을 가지고 있습니다. 반응 생성물은 염색되어 형광현미경으로 검출될 수 있습니다. 예를 들어 면역형광법을 사용하여 세포 내 액틴과 튜불린을 검출할 수 있습니다(IV장 참조).
현대 연구 방법을 사용하면 고정 세포와 살아있는 세포의 다양한 구조 구성 요소의 화학적 구성을 분석할 수 있습니다. 개별 세포 내 구조에 대한 연구는 세포 내용물을 분획하는 기술이 개발되면서 가능해졌습니다.
세포 내용물의 분별
세포 구조와 거대분자는 초원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 등 다양한 방법을 사용하여 분별할 수 있습니다. 이러한 방법은 생화학 교과서에 더 자세히 설명되어 있습니다.
초원심분리. 이 방법을 사용하면 세포를 소기관과 거대분자로 나눌 수 있습니다. 첫째, 세포는 삼투압 충격, 초음파 또는 기계적 작용에 의해 파괴됩니다. 이 경우 막(원형질막, 소포체)은 조각으로 분해되어 작은 소포가 형성되고 핵과 세포 소기관(미토콘드리아, 골지체, 리소좀 및 퍼옥시솜)은 그대로 유지되어 형성 현탁액에 있습니다.
위의 세포 성분을 분리하기 위해서는 고속 원심분리기(80,000~150,000rpm)를 사용합니다. 먼저, 더 큰 부분(핵, 세포골격)이 시험관 바닥에 침전(침전물)됩니다. 상청액 분획의 원심분리 속도가 더욱 증가하면 더 작은 입자가 순차적으로 침전됩니다(먼저 미토콘드리아, 리소좀 및 과산화소체, 그 다음 마이크로솜 및 작은 소포, 마지막으로 리보솜 및 큰 거대분자). 원심분리 중에 서로 다른 분획이 서로 다른 속도로 침전되어 테스트 튜브에 분리되어 검사될 수 있는 별도의 밴드가 형성됩니다. 분별된 세포 추출물(무세포 시스템)은 단백질 생합성 연구, 유전자 코드 해독 등 세포 내 과정을 연구하는 데 널리 사용됩니다.
크로마토그래피는 단백질 분획에 널리 사용됩니다.
전기영동을 사용하면 전하가 다른 단백질 분자를 전기장 내 수용액(또는 고체 다공성 매트릭스)에 배치하여 분리할 수 있습니다.
크로마토그래피와 전기영동 방법은 단백질 분자를 분할하여 얻은 펩타이드를 분석하고 소위 단백질의 펩타이드 맵을 얻는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 생화학 교과서에 자세히 설명되어 있습니다.
살아있는 세포의 화학적 조성에 대한 연구.살아있는 세포 내 물질의 분포와 대사를 연구하기 위해 핵자기공명법과 미세전극 기술이 사용됩니다.
핵자기공명(NMR)을 통해 저분자량 물질의 작은 분자를 연구할 수 있습니다. 조직 샘플은 서로 다른 분자와 서로 다른 환경에 있는 원자를 포함하므로 서로 다른 공명 주파수에서 에너지를 흡수합니다. 주어진 샘플의 공진 주파수에서의 흡수 다이어그램은 해당 샘플의 스펙트럼입니다. NMR.생물학에서는 양성자(수소핵)의 NMR 신호가 단백질, 핵산 등을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 살아있는 세포 내부의 거대분자를 연구하려면 동위원소 3H, 13C, 35K, 31R을 사용하여 다음과 같은 정보를 얻는 경우가 많습니다. NMR 신호를 보내고 세포 수명 동안의 변화를 모니터링합니다. 그래서, 3| P는 근육 수축, 즉 조직의 ATP 및 무기 인산염 함량 변화를 연구하는 데 사용됩니다. 13C 동위원소는 NMR을 사용하여 포도당이 관련된 많은 과정을 연구하는 것을 가능하게 합니다. NMR의 사용은 낮은 감도로 인해 제한됩니다. 살아있는 조직 1g에는 연구 중인 물질이 0.2mm 이상 포함되어 있어야 합니다. 이 방법의 장점은 살아있는 세포에 무해하다는 것입니다.
미세전극 기술. 미세전극은 전기 전도성 용액(일반적으로 물에 용해된 KS1 용액)으로 채워진 유리관으로, 끝의 직경은 1미크론 단위로 측정됩니다. 이러한 튜브의 끝은 형질막을 통해 세포의 세포질에 도입될 수 있으며 H + , Na + , K + , C1 ", Ca 2+ , Mg 2+ 이온의 농도, 형질막을 가로지르는 전위차를 결정할 수 있습니다. 특정 이온의 농도를 결정하기 위해 특정 이온만 투과할 수 있는 이온 교환 수지로 채워진 이온 선택성 전극이 사용됩니다. 원형질막의 특수 이온 채널(특수 단백질 채널)을 통한 이온 수송을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 경우, 원형질막의 해당 부분에 단단히 밀착되는 더 두꺼운 미세 전극이 사용됩니다. 이 방법을 사용하면 단일 단백질 분자의 기능을 연구할 수 있습니다. 발광 지표를 사용하여 세포 내 이온 농도의 변화를 확인할 수 있습니다. 해파리)는 Ca 2+ 이온이 있을 때 빛을 방출하고 0.5-10 μM 범위 내에서 후자의 농도 변화에 반응합니다. Ca 2+ 에 강하게 결합하는 형광 지시약도 합성되었습니다. 다양한 새로운 유형의 세포 내 지표 생성과 현대적인 이미지 분석 방법을 통해 많은 저분자 물질의 세포 내 농도를 정확하고 신속하게 결정할 수 있습니다.
정량적 방법
현재는 정성적 방법과 함께 정량적 조직화학적 방법이 개발되어 세포 및 조직 내 다양한 물질의 함량을 측정하는데 사용되고 있습니다. 정량적 조직화학적(생화학적 반대) 연구 방법의 특징은 세포와 조직의 특정 구조에서 화학 성분의 농도와 함량을 연구할 수 있다는 것입니다.
세포 분광 광도법- 흡수 스펙트럼을 통해 세포 내 물질을 정량적으로 연구하는 방법입니다.
세포분광형광법- 미리 선택된 하나의 파장에서 형광 스펙트럼 또는 형광 강도를 통해 세포 내 물질을 정량적으로 연구하는 방법(세포형광측정법).
현대 현미경 - 세포형광측정기다양한 구조(최대 10~14 -10~16g)에서 소량의 물질을 검출하고 미세 구조에서 연구 중인 물질의 위치를 평가할 수 있습니다.
세포 및 조직 구조의 이미지를 분석하는 방법
현미경, 텔레비전 디스플레이 화면, 전자 현미경 사진의 미세 물체 결과 이미지는 형태 측정, 밀도 측정 매개 변수 식별 및 통계 처리와 같은 특수 분석을 거칠 수 있습니다.
형태학적 방법특수 그리드 (E. Weibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanov)를 사용하여 모든 구조의 수, 면적, 직경 등을 결정할 수 있습니다. 특히 세포에서 핵 영역, 세포질, 직경은 측정, 핵-세포질 관계 등. 모든 매개변수가 자동으로 장치에 측정되고 기록되는 수동 형태측정 및 자동 형태측정이 있습니다.
최근에는 점점 더 널리 퍼지고 있습니다. 오토메이션이미지 처리 시스템(AIS),세포와 조직을 연구하기 위한 위의 정량적 방법을 가장 효과적으로 구현할 수 있습니다. 동시에 전자 컴퓨터를 사용하여 세포 및 조직의 이미지에서 추출한 처리 정보를 기반으로 시료를 분석하고 인식하는 방법으로 정량 현미경의 분석 기능을 보완합니다. 본질적으로 우리는 인간 시각 분석기의 광학적 능력을 향상시킬 뿐만 아니라 분석 능력을 크게 확장하는 장치에 대해 이야기할 수 있습니다. ACOI는 광학 현미경의 발명으로 약 300년 전, 그리고 약 50년 전 전자 현미경의 발명 덕분에 형태학에서 동일한 혁명을 일으키고 있다고 제안됩니다. 관찰을 객관화할 뿐 아니라 이전에 발견되지 않은 과정에 대한 새로운 정보를 얻고 세포와 조직에서의 발달을 수치적으로 모델링하고 예측할 수도 있습니다.
동시에, 컴퓨터 실험에 참여하려면 연구자는 구현에 대한 새로운 접근 방식을 갖고, 연구 과정을 위한 알고리즘을 작성하는 기술, 추론의 정확성을 보유하고, 궁극적으로 과학적, 방법론적 수준을 높여야 합니다. 연구의.
풀 수 있는 형태학적 문제의 수를 크게 늘린 방법 중 하나는 광학 구조 기계 분석(OSMA), Bogdanov가 1965년에 제안했습니다. 1978년에 이 방법의 저자는 소련 국가상을 수상했습니다. OSMA의 출현으로 통계적 특성을 기반으로 미세구조의 정량적 분석을 위한 통합 방법론 개발에 있어 질적으로 새로운 단계가 이루어졌습니다. 최근 OSMA는 연구 실무와 국가 경제에 효과적인 적용을 발견했습니다.
그림에서. 그림 2는 LOMO 회사가 우리나라에서 만든 Protva-MP 자동 영상 처리 시스템을 보여줍니다. 이 시스템은 흡수, 형광 현미경 및 자동방사선 촬영 방법을 사용하여 세포 및 조직의 복잡한 연구를 위해 설계되었습니다.
시스템에 포함된 특수 주사광학 또는 전자현미경은 약물의 이미지를 두 좌표계에서 순차적으로 관찰하여 디지털 형식으로 변환한 후 컴퓨터에 입력하면 컴퓨터에서 디지털 이미지 처리를 수행하고 기하학적 정보를 제공합니다. 그리고 분석된 객체의 다른 특성.
컬러 디스플레이를 사용하여 연구원은 이미지를 "해부"하여 관심 있는 구조적 구성 요소만 강조 표시할 수 있습니다. 컴퓨터에 포함된 자기 디스크나 테이프의 대용량 정보 저장 장치를 사용하면 이미지 자체와 후속 저장 및 문서화를 위해 처리 결과를 모두 저장할 수 있습니다.
혈액 백혈구의 이미지 처리 예를 사용하여 미세 물체의 자동 분석 방법을 고려해 보겠습니다(그림 3). 주사 현미경 광도계를 사용하면 광학 밀도 값을 한 줄씩 "볼" 수 있습니다. 연구원이 지정한 단계에 따라 물체의 광학 밀도에 해당하는 광학 신호가 특수 수학적 장치를 사용하여 준비되는 디지털 형식으로 변환됩니다.
먼저, 배경을 제거하고 "순수한" 물체(세포 이미지(1a))를 분리한 다음, 연구자가 관심을 갖는 모든 세부 사항(예: 세포질(16) 및 핵(I))을 세포 이미지에서 분리합니다. 광학 밀도, 분산, 비대칭, 첨도 등의 차수 평균 및 적분 값. 물체의 이미지로부터 면적, 둘레, 직경, 핵-세포질 비율, 형상 계수 등 형태학적 매개변수를 얻습니다.
이미지 처리의 다음 단계는 첫 번째 경우와 마찬가지로 전체 세포(그림 3 참조), 세포질(Shb) 및 핵(Shv)에 대한 광학 밀도의 상호 의존성에 대한 2차원 다이어그램을 구성하는 것입니다. 전체 세포(Sha)의 다이어그램, 세포질 단계를 구별할 수 있으며 커널 이 다이어그램을 사용하면 2차 히스토그램 매개변수(균질성, 국소 대비, 엔트로피 등)를 계산할 수 있습니다.
쌀. H. 자동화된 세포 이미지 처리(다이어그램).
백혈구(a), 세포질(b) 및 핵(c)의 이미지. 나 - 디지털 이미지; II - 광학 밀도 히스토그램; III - 광학 밀도 값의 의존성에 대한 2차원 히스토그램.
이러한 방식으로 얻은 매개변수는 세포의 다차원적인 "초상화"를 나타내며 특정 수치 표현을 갖습니다. 다양한 통계 처리 방법을 통해 미세 물체를 매우 정확하게 분류하고 시각적으로 감지할 수 없는 구조의 특징을 식별할 수 있습니다.
세포학 발달의 주요 단계
세포 발견의 역사
세포학(“cytos” – 세포, 세포)은 세포 과학입니다. 현대 세포학 연구: 세포의 구조, 기본 생활 시스템으로서의 형성, 개별 세포 구성 요소의 형성, 세포 재생 과정, 회복, 환경 조건에 대한 적응 및 기타 과정을 연구합니다. 즉, 현대 세포학은 세포의 생리학이다.
세포 연구의 발전은 현미경의 발명과 밀접한 관련이 있습니다 (그리스어 "micros"-작은 "skopeo"-내가 봅니다). 이는 인간의 눈이 0.1mm, 즉 100마이크로미터(약어로 마이크론 또는 μm)보다 작은 물체를 구별할 수 없기 때문입니다. 세포의 크기(더 나아가 세포 내 구조)는 훨씬 더 작습니다.
예를 들어, 동물 세포의 직경은 일반적으로 20미크론을 초과하지 않으며, 식물 세포는 50미크론, 꽃 피는 식물의 엽록체 길이는 10미크론을 넘지 않습니다. 광학현미경을 사용하면 직경이 10분의 1미크론인 물체를 구별할 수 있습니다.
최초의 현미경은 1610년 갈릴레오에 의해 설계되었으며 납관에 렌즈가 결합된 형태였습니다. (그림 1.1).그리고 1590년에 이 발견이 있기 전에 네덜란드의 거장 Jansens는 유리 생산에 종사했습니다.
쌀. 1.1. 갈릴레오 갈릴레이 (1564-1642)
영국의 물리학자이자 박물학자인 R. Hooke는 연구를 위해 현미경을 최초로 사용한 사람입니다. (그림 1.2, 1.4). 1665년에 그는 처음으로 코르크의 세포 구조를 기술하고 "세포"라는 용어를 만들었습니다. (그림 1.3). R. Hooke는 특정 부피의 플러그에 있는 세포 수를 계산하려는 첫 번째 시도를 했습니다.
그는 세포라는 개념을 세포로 공식화하고 모든면이 완전히 닫혀 있으며 식물 조직의 세포 구조에 대한 사실을 확립했습니다. 이 두 가지 주요 결론은 이 분야의 추가 연구 방향을 결정했습니다.
쌀. 1.2. 로버트 훅 (1635-1703)
쌀. 1.3. Robert Hooke가 연구한 코르크 세포
쌀. 1.4. 로버트 훅 현미경
1674년 네덜란드 상인 Antonio van Leeuwenhoek는 현미경을 사용하여 처음으로 물 한 방울에서 움직이는 살아있는 유기체(단세포 유기체, 혈액 세포, 정자)인 "동물"을 보고 이를 과학계에 보고했습니다. (그림 1.5, 1.6). 이러한 "동물"에 대한 설명은 네덜란드인에게 세계적인 명성을 안겨주었고 살아있는 미시세계 연구에 대한 관심을 불러일으켰습니다.
쌀. 1.5. 안토니오 반 레이우엔훅(1632-1723)
쌀. 1.6. Antonio van Leeuwenhoek의 현미경
1693년 Peter I가 Delphi에 머무는 동안 A. Leeuwenhoek은 그에게 물고기 지느러미에서 혈액이 어떻게 움직이는지 보여주었습니다. 이러한 시연은 Peter I에게 큰 인상을 주었고 러시아로 돌아와서 광학 기기 작업장을 만들었습니다. 1725년에는 상트페테르부르크 과학 아카데미가 조직되었습니다.
재능있는 마스터 I.E. Belyaev, I.P. Kulibin은 현미경을 만들었습니다. (그림 1.7, 1.8, 1.9), 학자 L. Euler와 F. Epinus가 참여한 디자인입니다.
쌀. 1.7. I.P. 쿨리빈 (1735-1818)
쌀. 1.8. 즉. 벨랴예프
쌀. 1.9. 러시아 장인이 만든 현미경
1671~1679년 이탈리아의 생물학자이자 의사인 마르첼로 말피기(Marcello Malpighi)는 식물 해부학의 기초를 마련한 식물 기관의 미세 구조에 대한 최초의 체계적인 설명을 제공했습니다. (그림 1.10).
쌀. 1.10. 마르첼로 말피기(1628-1694)
1671~1682년 영국인 Nehemiah Grew는 식물의 미세 구조를 자세히 설명했습니다. "거품"이나 "가방"의 집합체 개념을 지칭하기 위해 "티슈"라는 용어를 도입했습니다. (그림 1.11). 이 두 연구원(서로 독립적으로 작업함)은 놀랍도록 정확한 설명과 그림을 제공했습니다. 그들은 소포로부터 식물 조직을 구성하는 보편성에 관해 동일한 결론에 도달했습니다.
쌀. 1.11. 느헤미야 성장 (1641-1712)
XIX 세기의 20년대. 식물과 동물 조직 연구 분야에서 가장 중요한 연구는 프랑스 과학자 Henri Dutrochet(1824), Francois Raspail(1827) 및 Pierre Turpin(1829)의 작품입니다. 그들은 세포(낭, 소포)가 모든 식물과 동물 조직의 기본 구조임을 증명했습니다. 이 연구는 세포 이론 발견의 길을 열었습니다.
발생학 및 비교 해부학의 창시자 중 한 명인 상트페테르부르크 과학 아카데미의 학자인 Karl Maksimovich Baer는 세포가 구조뿐만 아니라 유기체 발달의 단위임을 보여주었습니다. (그림 1.12).
쌀. 1.12. K.M. 베어 (1792-1876)
1759년 독일의 해부학자이자 생리학자인 카스파 프리드리히 볼프(Caspar Friedrich Wolf)는 세포가 성장의 단위임을 증명했습니다. (그림 1.13).
쌀. 1.13. K. F. 늑대 (1733-1794)
1830년대 체코의 생리학자이자 해부학자인 J.E. 퍼킨 (그림 1.14), 독일 생물 학자 I.P. Muller는 세포 조직이 모든 유형의 조직에 보편적이라는 것을 증명했습니다.
쌀. 1.14. 예.E. 퍼킨 (1787-1869)
1833년 영국의 식물학자 R. 브라운 (그림 1.15)식물세포의 핵을 기술하였다.
쌀. 1.15. 로버트 브라운 (1773-1858)
1837년 마티아스 야콥 슐라이덴 (그림 1.16)이 과정에서 세포핵의 결정적인 역할을 인식하면서 식물 세포 형성에 대한 새로운 이론을 제안했습니다. 1842년에 그는 처음으로 핵에서 핵소체를 발견했습니다.
현대 사상에 따르면 Schleiden의 특정 연구에는 많은 오류가 포함되어 있습니다. 특히 Schleiden은 세포가 구조 없는 물질에서 발생할 수 있고 식물 배아가 꽃가루 관에서 발생할 수 있다고 믿었습니다(생명의 자연 발생 가설).
쌀. 1.16. 마티아스 야콥 슐라이덴(1804-1881)
독일의 세포학자, 조직학자, 생리학자인 Theodor Schwann (그림 1.17)식물 세포에서 핵의 역할을 설명한 독일 식물학자 M. Schleiden의 연구에 대해 알게 되었습니다. 이 연구를 자신의 관찰과 비교하여 Schwann은 세포 구조와 살아있는 유기체의 발달에 대한 자신의 원리를 개발했습니다.
1838년에 슈반은 세포 이론에 대한 세 가지 예비 보고서를 발표했고, 1839년에는 "동물과 식물의 구조와 성장의 일치에 관한 현미경 연구"라는 작품을 발표했습니다. 살아있는 유기체.
F. 엥겔스는 세포 이론의 창설을 에너지 변환 법칙, 진화론과 함께 19세기 자연과학의 3대 발견 중 하나로 꼽았습니다.
쌀. 1.17. 테오도르 슈반(1810-1882)
1834~1847년 상트페테르부르크 P.F.의 의학-외과 아카데미 교수 고리야니노프 (그림 1.18)세포가 생명체 조직의 보편적 모델이라는 원리를 공식화했습니다.
Goryaninov는 생명체의 세계를 무형, 분자 왕국, 유기 또는 세포 왕국의 두 왕국으로 나누었습니다. 그는 "...유기체 세계는 기본적으로 세포 왕국입니다..."라고 썼습니다. 그는 연구에서 모든 동물과 식물이 소포라고 불리는 상호 연결된 세포로 구성되어 있음을 지적했습니다. 즉, 식물과 동물의 일반적인 구조에 대한 의견을 표명했습니다.
쌀. 1.18. P.F. 고리야니노프(1796-1865)
세포 이론의 발전 역사에서 두 단계로 구분할 수 있습니다.
1) 식물과 동물의 다양한 단세포 및 다세포 유기체의 구조에 대한 관찰이 축적된 기간(약 300년)
2) 1838년에 이용 가능한 데이터가 일반화되고 세포 이론의 가정이 공식화되는 기간;
무르만스크 주립 기술 대학교
생물학과
주제에 대해 보고합니다:
"세포학의 연구 방법"
완전한:
1학년 학생
기술 학부
학과 생물학
세레브랴코바 라다 뱌체슬라보브나
확인됨:
무르만스크2001
계획:
1. 세포학은 무엇을 연구하나요?
2. 유기체가 세포로 구성되어 있다는 생각.
3. 세포학에 사용되는 연구 방법.
4. 세포분획.
5. 자동 방사선 촬영.
6. 자동 방사선 사진을 사용하여 세포주기의 일부 단계의 지속 시간을 결정합니다.
세포학은 세포의 과학입니다. 그것은 거의 100년 전에 다른 생물학에서 나타났습니다. 처음으로 세포 구조에 대한 일반화 된 정보가 J.-B의 책에 수집되었습니다. 카노이의 세포생물학(1884년 출판) 현대 세포학은 세포의 구조와 기본 생명체로서의 기능을 연구합니다. 개별 세포 구성 요소의 기능, 세포 재생 과정, 복구, 환경 조건에 대한 적응 및 기타 여러 과정을 연구하여 속성과 기능을 판단할 수 있습니다. 모든 세포에 공통적입니다. 세포학은 또한 특수 세포의 구조적 특징을 검사합니다. 즉, 현대 세포학은 세포의 생리학이다. 세포학은 생화학, 생물물리학, 분자생물학 및 유전학의 과학적, 방법론적 성과와 밀접한 관련이 있습니다. 이것은 이러한 과학의 관점에서 세포에 대한 심층 연구와 세포의 특정 합성 과학, 즉 세포 생물학 또는 세포 생물학의 출현을 위한 기초가 되었습니다. 현재 세포학과 세포생물학이라는 용어는 일치합니다. 왜냐하면 연구 주제가 자체적인 조직 및 기능 패턴을 가진 세포이기 때문입니다. "세포 생물학"이라는 학문은 생물학의 기본 부분을 의미합니다. 왜냐하면 지구상의 모든 생명체의 유일한 단위인 세포를 연구하고 설명하기 때문입니다.
세포에 대한 장기간의 신중한 연구는 일반적인 생물학적 중요성에 대한 중요한 이론적 일반화, 즉 세포 이론의 출현으로 이어졌습니다. 17세기에 뛰어난 창의력을 지닌 물리학자이자 생물학자인 로버트 훅(Robert Hooke)은 현미경으로 코르크의 얇은 부분을 조사하면서 그것이 얇은 벽으로 분리된 작은 빈 세포로 이루어져 있다는 사실을 발견했습니다. 이 세포는 현재 우리가 알고 있듯이 셀룰로오스로 구성되어 있습니다. . 그는 이 작은 세포를 세포라고 불렀습니다. 나중에 다른 생물학자들이 현미경으로 식물 조직을 조사하기 시작했을 때 Hooke가 죽고 시든 마개에서 발견한 작은 세포가 살아있는 식물 조직에도 존재한다는 것이 밝혀졌습니다. 작은 젤라틴 몸체. 동물 조직을 현미경으로 조사한 결과, 이들 조직도 작은 젤라틴 몸체로 구성되어 있지만 이러한 몸체는 벽으로 거의 분리되지 않는다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 모든 연구의 결과, 1939년 Schleiden과 Schwann은 독립적으로 연구를 진행했습니다. 세포는 모든 식물과 동물이 궁극적으로 만들어지는 기본 단위라고 말하는 세포 이론입니다. 한동안 세포라는 단어의 이중 의미는 여전히 오해를 불러일으켰지만, 점차 이 작은 젤리 같은 몸체에 확고하게 자리 잡았습니다.
세포에 대한 현대의 이해는 연구 방법의 기술 발전 및 개선과 밀접한 관련이 있습니다. 그 역할을 잃지 않은 기존의 광학현미경 외에도 지난 수십 년 동안 편광, 자외선, 형광, 위상차 현미경 등이 큰 중요성을 띠고 있습니다. 그 중에서도 전자현미경은 특별한 위치를 차지하고 있으며, 그 분해능 덕분에 세포의 초미세 및 분자 구조를 관통하고 연구할 수 있습니다. 현대 연구 방법을 통해 세포 조직의 상세한 그림을 밝힐 수 있게 되었습니다.
각 세포는 핵과 세포질로 구성되어 있으며 막으로 서로 분리되어 있으며 외부 환경과도 분리되어 있습니다. 세포질의 구성 요소는 막, 유리질, 소포체 및 리보솜, 골지체, 리소좀, 미토콘드리아, 내포물, 세포 중심, 특수 세포 소기관입니다.
특별한 기능을 수행하는 유기체의 일부를 기관이라고 합니다. 예를 들어 폐, 간, 신장 등 모든 기관은 고유한 구조를 갖고 있어 신체에서 특정 역할을 합니다. 마찬가지로, 세포질에는 특별한 구조가 있는데, 그 독특한 구조로 인해 세포의 신진 대사에 필요한 특정 기능을 수행할 수 있습니다. 이러한 구조를 소기관("작은 기관")이라고 합니다.
세포질 소기관의 성질, 기능 및 분포에 대한 설명은 현대 세포 생물학 방법이 개발된 후에야 가능해졌습니다. 이와 관련하여 가장 유용한 것은 다음과 같습니다. 1) 전자 현미경; 2) 생화학자가 특정 소기관을 포함하는 상대적으로 순수한 세포 분획을 분리하여 관심 있는 개별 대사 반응을 연구할 수 있는 세포 분별; 3) 세포 소기관에서 발생하는 개별 대사 반응을 직접적으로 연구할 수 있는 자가방사선 촬영.
세포 소기관을 세포로부터 분리하는 방법을 분별(fractionation)이라고 합니다. 이 방법은 생화학자들에게 비교적 순수한 형태로 다양한 세포 소기관을 분리할 수 있는 기회를 제공함으로써 매우 유익한 것으로 나타났습니다. 또한, 이를 통해 세포소기관과 그 안에 포함된 효소의 화학적 조성을 결정하고, 얻은 데이터를 기반으로 세포 내 기능에 대한 결론을 도출할 수 있습니다. 첫 번째 단계로 세포 소기관의 안전성을 보장하고 응집을 방지하는 적절한 배지에서 세포를 균질화하여 파괴하는 경우가 많습니다. 미토콘드리아와 다른 많은 세포 소기관은 그대로 남아 있지만 소포체 및 원형질막과 같은 막 구조는 조각으로 분해됩니다. 그러나 생성된 막 조각은 종종 스스로 닫혀서 다양한 크기의 둥근 소포가 생성됩니다.
다음 단계에서 세포 균질액은 일련의 원심분리를 거치게 되는데, 원심분리 속도와 지속 시간은 매번 증가합니다. 이 과정을 차등 원심분리라고 합니다. 서로 다른 세포 소기관은 소기관의 크기, 밀도 및 모양에 따라 다양한 원심분리 속도로 원심분리 튜브 바닥에 침전됩니다. 생성된 침전물을 수집하고 검사할 수 있습니다. 핵과 같이 더 크고 밀도가 높은 구조는 가장 빠르게 침전되는 반면, 소포체 소포와 같이 더 작고 밀도가 낮은 구조는 가장 오랜 시간 동안 더 높은 속도를 요구합니다. 따라서 낮은 원심분리 속도에서는 핵이 침전되고 다른 세포 소기관은 현탁액에 남아 있습니다. 더 높은 속도에서는 미토콘드리아와 리소좀이 침전되고, 장기간 원심분리와 매우 빠른 속도를 사용하면 리보솜과 같은 작은 입자도 침전됩니다. 생성된 분획의 순도를 결정하기 위해 전자현미경을 사용하여 침전물을 검사할 수 있습니다. 모든 분획은 어느 정도 다른 세포 소기관으로 오염되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 분획물의 순도를 충분히 달성할 수 있는 경우, 분리된 소기관의 화학적 조성과 효소 활성을 결정하기 위해 생화학적 분석을 실시합니다.
비교적 최근에는 밀도 구배 원심 분리라는 또 다른 세포 분별 방법이 만들어졌습니다. 이 경우, 농도가 계속 증가하여 밀도가 증가하는 자당 용액이 먼저 서로 겹쳐지는 시험관에서 원심 분리가 수행됩니다. 원심분리 중에 균질액에 포함된 소기관은 자당 용액이 위치하는 수준의 밀도에 해당하는 원심분리 튜브에 위치합니다. 이 방법은 생화학자들에게 크기는 동일하지만 밀도가 다른 세포소기관을 분리할 수 있는 기회를 제공합니다(그림 1).
자동방사선촬영은 광학현미경과 전자현미경의 능력을 엄청나게 확장한 비교적 새로운 방법입니다. 이는 핵물리학의 발달로 인해 매우 현대적인 방법으로 다양한 원소의 방사성 동위원소를 얻을 수 있게 되었습니다. 방사선 자동촬영에는 특히 세포에 의해 사용되거나 세포에 의해 사용되는 물질에 결합할 수 있고 정상적인 세포 대사를 방해하지 않는 양으로 동물에 투여되거나 배양물에 추가될 수 있는 요소의 동위원소가 필요합니다. 방사성 동위원소(또는 이를 표시한 물질)는 비방사성 동위원소와 동일한 방식으로 생화학 반응에 참여하고 동시에 방사선을 방출하므로 다양한 검출 방법을 사용하여 체내 동위원소의 경로를 추적할 수 있습니다. 방사능. 방사능을 검출하는 한 가지 방법은 빛과 같은 사진 필름에 작용하는 능력을 기반으로 합니다. 그러나 방사선은 빛으로부터 필름을 보호하기 위해 사용되는 검은 종이를 관통하여 필름에 빛과 동일한 영향을 미칩니다.
연구용 제제에서 광학현미경이나 전자현미경을 사용하여 방사성 동위원소에서 방출되는 방사선을 검출하기 위해 제제를 암실에서 특수 사진 유제로 코팅한 후 일정 시간 동안 암실에 방치합니다. 그런 다음 준비가 현상되고(어두운 곳에서도) 고정됩니다. 방사성 동위원소를 함유한 약물 영역은 방출된 방사선의 영향으로 어두운 "입자"가 나타나는 기본 유제에 영향을 미칩니다. 따라서 방사선 사인이 얻어집니다 (그리스어로. 라디오– 방출하다, 자동차– 그 자신과 그래프- 쓰다).
처음에 조직학자들은 방사성 동위원소가 몇 개밖에 없었습니다. 예를 들어, 많은 초기 방사선 사진 연구에서는 방사성 인을 사용했습니다. 나중에 이러한 동위원소가 더 많이 사용되었습니다. 수소의 방사성 동위원소인 삼중수소는 특히 널리 사용됩니다.
자가방사선촬영은 신체에서 특정 생화학 반응이 어디서 어떻게 일어나는지 연구하는 데 과거에도 여전히 널리 사용됩니다.
생물학적 과정을 연구하는 데 사용되는 방사성 동위원소로 표시된 화합물을 전구체라고 합니다. 일반적으로 신체가 음식에서 얻는 물질과 유사한 물질입니다. 이들은 조직 구성을 위한 빌딩 블록 역할을 하며, 라벨이 없는 빌딩 블록이 통합되는 것과 같은 방식으로 세포와 조직의 복잡한 구성 요소에 통합됩니다. 표지된 전구체가 포함되고 방사선을 방출하는 조직 구성요소를 제품이라고 합니다.
배양에서 성장한 세포는 동일한 유형에 속하더라도 주기를 동기화하기 위한 특별한 조치를 취하지 않는 한 주어진 시간에 세포 주기의 서로 다른 단계에 있게 됩니다. 그러나 삼중수소-티미딘을 세포에 도입한 후 자가방사선 사진을 촬영함으로써 주기의 다양한 단계의 지속 시간을 결정하는 것이 가능합니다. 한 단계(유사분열)의 시작 시간은 표지된 티미딘 없이 결정될 수 있습니다. 이를 위해 배양액의 세포 샘플을 위상차 현미경으로 관찰하여 유사분열의 진행 상황을 직접 모니터링하고 시기를 결정할 수 있습니다. 유사분열 기간은 일반적으로 1시간이지만 일부 세포 유형에서는 최대 1.5시간이 소요됩니다.
기간의 정의G2교시.
G 2 기간의 지속 시간을 결정하기 위해 다음과 같은 방법이 사용됩니다. 펄스 태그:표지된 티미딘을 세포 배양물에 첨가하고, 짧은 시간 후에 배양 배지를 새로운 것으로 교체하여 표지된 티미딘이 세포에 의해 더 이상 흡수되는 것을 방지합니다. 이 경우, 라벨은 삼중수소-티미딘이 포함된 배지에 잠시 머무르는 동안 세포 주기의 S 기간에 있었던 세포에만 포함됩니다. 그러한 세포의 비율은 작으며 세포의 작은 부분만이 라벨을 받게 됩니다. 또한 라벨을 포함하는 모든 세포는 S 기간에 거의 진입하지 않은 세포부터 삼중수소-티미딘에 노출되는 동안 S 기간을 거의 완료한 세포까지 간기에 있게 됩니다. 표지된 티미딘을 제거한 직후 채취한 샘플에서는 표지에 노출된 기간 동안 S 기간에 있었던 세포에 속하는 간기 핵에만 표지가 포함되어 있습니다. 이 기간 동안 유사분열 상태에 있던 세포는 표지되지 않은 상태로 유지됩니다.
그런 다음 일정한 간격으로 배양액에서 샘플을 계속 채취하고 각 연속 샘플에 대해 자동 방사선 사진을 준비하면 라벨이 표시되기 시작하는 순간이 올 것입니다. 유사분열디-염색체. 배지에 삼중수소-티미딘이 존재하는 동안 S 기간에 있었던 모든 세포에 라벨이 포함될 것이며, 이들 세포 중에는 S 기간에 막 들어간 세포와 S 기간이 거의 완료된 세포가 있을 것입니다. 이 후자가 유사분열을 겪는 표지된 세포 중 첫 번째가 될 것이므로 유사분열 염색체에서 표지가 검출될 것이라는 것은 매우 분명합니다. 따라서, 1) 표지된 티미딘이 배양물에서 제거된 시간과 2) 표지된 유사분열 염색체의 출현 시간 사이의 간격은 세포 주기의 G 2 기간의 지속 기간에 해당할 것입니다.
기간의 정의에스-기간.
라벨이 배지에 도입될 때 S 기간의 맨 끝에 있는 세포가 유사분열에 가장 먼저 들어가게 되므로 라벨이 제거되기 직전에 S 기간이 시작되는 세포에서는 , 라벨이 붙은 유사분열 염색체가 마지막에 나타납니다. 따라서 처음 표시된 세포의 유사분열 진입 시간과 마지막 표시된 세포 사이의 간격을 결정할 수 있다면 S 기간의 기간을 설정할 수 있습니다. 그러나 표지된 유사분열 염색체가 처음 나타나는 시간은 결정하기 쉽지만 마지막 표지된 세포가 유사분열에 들어가는 시간은 결정될 수 없습니다(이는 후자 샘플에서 표지된 분열 세포의 수가 매우 많기 때문에 방해됩니다). 따라서 S 기간의 기간은 다른 방식으로 결정되어야 합니다.
동일한 시간 간격으로 채취한 연속적인 세포 샘플의 자가방사선 사진을 검사할 때, 유사분열 염색체에 라벨을 보유하는 세포의 비율이 문자 그대로 모든 분열 세포에 라벨이 붙을 때까지 점차 증가한다는 사실이 밝혀졌습니다. 그러나 세포가 하나씩 유사분열을 완료하면 표지된 간기 세포가 됩니다. 유사분열을 완료하는 첫 번째 세포는 처음으로 들어간 표지된 세포의 세포입니다. 따라서 표지된 유사분열 염색체를 가진 세포 중 마지막에서 완전한 유사분열이 이루어진 세포는 모든 세포보다 나중에 세포분열에 들어간 세포입니다. 유사분열 기간은 항상 동일하므로 1) 먼저 표시를 켠 세포의 유사분열이 끝나는 시간과 2) 유사분열이 끝나는 시간 사이의 간격을 결정할 수 있다면 마지막으로 표시를 켠 세포의 유사분열을 통해 S 기간의 기간을 설정합니다. S 기간은 다음 사이의 간격을 결정하여 쉽게 설정할 수 있습니다. 1) 50%가 되는 시점. 배양물 중 유사분열 세포는 표지되지 않았으며, 2) 배양물에 표지된 세포의 50%가 더 이상 포함되지 않는 시점.
생성 시간 결정(전체 세포 주기의 총 지속 시간)
배양에서 세포 샘플을 계속 채취하면 표시된 유사분열 수치가 어느 시점에서 완전히 사라졌다가 다시 나타나는 것을 확인할 수 있습니다. 이러한 분열세포는 삼중수소-티미딘에 노출되었을 때 S기간에 있을 때 표지를 켠 모세포에서 유래한 딸세포이다. 이러한 모세포는 S기에 진입하여 분열한 후 두 번째 간기와 두 번째 분열을 거쳤습니다. 즉, 한 번의 전체 주기와 다음 주기의 일부를 거쳤습니다. 완전한 세포주기를 완료하는 데 필요한 시간을 시간이라고 합니다. 세대.이는 라벨 통합의 두 연속 피크 사이의 간격에 해당하며 일반적으로 유사분열 수치의 50%에 라벨이 포함된 연속적인 상승 곡선 지점 사이의 간격에 해당합니다.
문학.
A. Ham, D. Cormack “조직학”, 1권 모스크바 “MIR” 1982;
M.G. Abramov “임상 세포학” 모스크바 “의료” 1974;
Y.S.Chentsov “일반 세포학”
세포 수준의 생명 조직
§ 16. 세포 연구의 역사. 세포학 연구 방법.
세포 연구의 역사.
세포의 세계는 사람들이 시력을 향상시키기 위해 렌즈를 갈아서 사용하는 방법을 배운 17세기 중반까지 완전히 알려지지 않았습니다.
현미경의 최초 창시자 중 한 명은 로버트 훅물리학자, 기상학자, 생물학자, 엔지니어, 건축가. 안에 1665년그는 현미경으로 관찰한 내용을 담은 "매크로그래피"라는 그림 앨범을 출판했습니다.
Hooke의 동시대 재능있는 사람 중 한 명은 네덜란드 사람이었습니다. 앤서니 반 레이우엔훅,그는 자신의 특별한 디자인으로 200개의 현미경을 만들었습니다. 레이벤훅은 물체의 270배 증가를 달성하고 뛰어난 발견을 했습니다.
1833년 로버트 브라운세포에서 핵을 발견했습니다. 후에 1825년 얀 푸르키네현미경 장비용 준비 및 염색을 위한 효과적인 방법을 개발했습니다.
식물에 대해 제안된 세포 이론 1837년독일의 식물학자 마티아스 슐라이덴,그리고 그의 친구인 생리학자에 의해 동물의 세계로 확장되었습니다. 테오도르 슈반.조금 있다가 보완됐어요 루돌프 피르호프,어느 1885년"모든 세포는 세포에서 나온다"라는 명제를 공식화했습니다.
19세기 중반. 세포 이론은 일반적으로 받아들여졌고 세포 과학의 기초가 되었습니다. 세포학. 19세기 말까지. 세포의 많은 구성 요소가 발견되었습니다. 과학자들은 그것들을 기술하고 이름을 붙였습니다.
하지만 1945년세포학자들은 처음으로 전자현미경을 사용하여 세포를 관찰했고 이전에 알려지지 않았던 많은 구조를 발견했습니다. 따라서 세포학 발전의 결정적인 역할은 다른 과학, 특히 물리학의 새로운 발견에 속합니다.
세포학 연구 방법.
주요 방법은 광학 현미경 방법.광학현미경을 사용하여 검사하지만 특별히 준비된 세포학적 제제만 광학현미경으로 검사할 수 있습니다.
준비를 준비하기 위해 세포학자는 유리 슬라이드와 검사할 수 있도록 특별히 준비된 물체를 사용합니다.
대부분의 경우 이러한 구조는 무색이므로 보고 싶은 구조에 따라 매번 다른 특수 염료로 칠해야 합니다.
두 가지 방법이 있습니다:압력 제제를 준비하는 방법 - 연구 대상을 단순히 슬라이드와 커버 유리 사이의 한 층으로 분쇄하는 방법과 단일 층의 세포로 구성된 얇은 섹션을 준비하는 방법.
살아있는 세포를 연구하는 데 사용됩니다. 위상차 현미경 방법.이는 투명 셀의 개별 부분이 밀도와 빛 굴절이 서로 다르다는 사실에 기초합니다.
살아있는 세포를 연구할 때 그들은 또한 다음을 사용합니다. 형광현미경법.그 의미는 많은 물질이 빛 에너지를 흡수할 때 빛을 발하는 능력을 가지고 있다는 사실에 있습니다. 예를 들어, 형광 현미경을 통해 식물 세포를 보면 진한 파란색 몸체에 밝게 빛나는 붉은 입자가 보입니다. 이것이 엽록체입니다.
표지 동위원소를 사용하는 방법이 있습니다. 자가 방사선 촬영 방법- 동위원소로 표지된 물질의 등록. 이 방법을 사용하면 세포의 어느 부분이 방사성 동위원소로 표시된 물질을 받는지 확인할 수 있습니다.
전자현미경법세포학자는 빛의 파장보다 작은 크기를 가진 세포 구조를 발견했습니다. 이 방법 덕분에 단백질 합성이 일어나는 바이러스와 세포 소기관(리보솜)을 조사하는 것이 가능해졌습니다.
세포학자는 또한 다음을 사용하여 세포의 다양한 구성 요소를 얻고 연구할 수 있습니다. 세포 분별.세포는 먼저 파괴된 다음 특수 장치인 원심분리기를 사용하여 세포 구조를 분리합니다.
세포 배양을 이용하는 방법인간, 동물, 식물체로부터 분리된 세포, 조직, 소기관 또는 그 일부를 특수 영양배지에서 장기간 보관, 배양하는 방법이다. 이 방법의 중요한 장점은 현미경을 사용하여 세포의 필수 활동을 관찰할 수 있다는 것입니다.
인간 질병의 진단 및 치료에 있어서 세포학적 방법의 중요성.
1) 세포학적 방법세포 구조 연구를 기반으로 인체의 생리적 상태를 연구하기 위해 의학에서 사용됩니다. 그들은 혈액 질환을 식별하고 악성 및 양성 종양, 호흡기 질환, 소화, 배뇨, 신경계 및 치료의 많은 질병을 식별하는 데 사용됩니다.
2) 줄기세포자가 재생이 가능하고 신체의 특수 세포로 발달할 수 있는 미성숙 세포입니다. 성인의 신체에서 줄기세포는 주로 골수에서 발견되며 모든 기관과 조직에서 매우 적은 양으로 발견됩니다. 그들은 많은 질병을 치료하는 데 사용될 수 있습니다.
§ 17. 원핵세포와 진핵세포의 구조.
세포 구조의 통일성.
모든 셀의 내용은 특별한 구조에 의해 외부 환경과 분리됩니다. 원형질막 (plasmalemma).이러한 격리를 통해 주변 환경과 달리 세포 내부에 매우 특별한 환경을 만들 수 있습니다. 따라서 다른 곳에서는 발생하지 않는 프로세스가 셀에서 발생할 수 있습니다. 생활 과정.
원형질막으로 둘러싸인 살아있는 세포의 내부 환경을 환경이라고 합니다. 세포질.그것은 다음을 포함합니다 유리질체(기본 투명 물질) 및 세포 소기관,다양한 비영구적 구조물뿐만 아니라 - 포함.모든 세포에 존재하는 세포 소기관에는 다음이 포함됩니다. 리보솜,어디서 그런 일이 일어나는지 단백질 합성.
진핵 세포의 구조.
진핵생물- 세포에 핵이 있는 유기체입니다. 핵심- 이것은 염색체에 기록된 유전 정보가 저장되고 유전 정보가 전사되는 진핵 세포의 세포 소기관입니다. 염색체단백질과 통합된 DNA 분자이다. 핵심은 다음과 같습니다 핵소체- 단백질 합성에 관여하는 다른 중요한 소기관이 형성되는 곳 - 리보솜.그러나 리보솜은 핵에서만 형성되며 세포질에서 작동(즉, 단백질 합성)합니다. 그들 중 일부는 세포질에 자유로이 존재하고, 일부는 막에 부착되어 네트워크를 형성합니다. 소포체.
리보솜- 비막 소기관.
소포체막으로 둘러싸인 세뇨관의 네트워크입니다. 부드러운 유형과 세분화된 유형의 두 가지 유형이 있습니다. 리보솜은 과립 소포체의 막에 위치하므로 단백질이 합성되어 그곳으로 운반됩니다. 그리고 평활 소포체는 탄수화물과 지질의 합성과 운반 장소입니다. 거기에는 리보솜이 없습니다.
단백질, 탄수화물 및 지방의 합성에는 에너지가 필요하며, 이는 진핵 세포의 "에너지 스테이션"에 의해 생성됩니다. 미토콘드리아.
미토콘드리아- 세포 호흡 과정이 일어나는 이중막 소기관. 유기화합물은 미토콘드리아 막에서 산화되고 화학에너지는 특수한 에너지 분자의 형태로 축적됩니다. (ATP).
또한 세포에는 유기 화합물이 축적되고 운반될 수 있는 장소가 있습니다. 골지체,편평한 멤브레인 백 시스템. 단백질, 지질, 탄수화물의 수송에 관여합니다. 골지체는 또한 세포내 소화를 위한 소기관을 생성합니다. 리소좀.
리소좀- 동물 세포의 특징인 단일막 소기관에는 단백질, 탄수화물, 핵산 및 지질을 분해할 수 있는 효소가 포함되어 있습니다.
세포는 리보솜이나 세포골격과 같이 막 구조가 없는 세포소기관을 포함할 수 있습니다.
세포골격- 이것은 세포의 근골격계로, 미세섬유, 섬모, 편모, 미세소관과 중심소체를 생성하는 세포 중심을 포함합니다.
식물 세포에만 특징적인 세포 소기관이 있습니다 - 색소체.엽록체, 발색체, 백혈구가 있습니다. 광합성 과정은 엽록체에서 발생합니다.
식물세포에서도 액포- 물과 그 안에 용해된 화합물의 저장소인 세포의 노폐물. 진핵 생물에는 식물, 동물 및 곰팡이가 포함됩니다.
원핵 세포의 구조.
원핵생물- 세포에 핵이 없는 단세포 유기체.
원핵세포는 크기가 작고 원형 DNA 분자(핵양체) 형태로 유전 물질을 저장합니다. 원핵 생물에는 박테리아와 남세균이 포함되며, 이전에는 남조류라고 불렸습니다.
원핵 생물에서 호기성 호흡 과정이 발생하면 원형질막의 특수 돌출부가 사용됩니다. 메소솜.박테리아가 광합성을 하면 광합성 과정은 광합성 막에서 발생합니다. 틸라코이드.
원핵생물의 단백질 합성은 다음에서 일어난다. 리보솜.원핵세포에는 소기관이 거의 없습니다.
진핵 세포 소기관의 기원에 대한 가설.
원핵세포는 진핵세포보다 먼저 지구에 나타났습니다.
1) 공생 가설진핵 세포의 일부 세포 기관인 미토콘드리아와 광합성 색소체의 출현 메커니즘을 설명합니다.
2) 장중첩증 가설- 진핵세포의 기원은 조상 형태가 호기성 원핵생물이었다는 사실에서 비롯된다고 말합니다. 그 안에 있는 소기관은 껍질 부분의 함입 및 분리의 결과로 발생했으며, 이어서 다른 소기관의 핵, 미토콘드리아, 엽록체로의 기능적 전문화가 뒤따랐습니다.
§ 18. 세포막. 막을 통한 물질의 수송. 세포의 표면 장치와 그 기능.
세포막.
생물학적 막- 이들은 세포 표면과 세포 내 부분뿐만 아니라 원형질을 관통하는 세뇨관과 소포에 위치한 분자 크기의 얇은 인접 구조입니다. 생물학적 막의 기능은 이온, 당, 아미노산 및 기타 대사 산물의 수송을 조절하는 것입니다.
모든 막의 기본은 인지질의 이중층입니다.
그러나 빌리피드층은 이미 만들어진 막이 아니라 그 기초일 뿐입니다. 단백질이라고 불리는 막 단백질.막의 많은 특성을 결정하는 것은 막 단백질입니다. 탄수화물은 또한 세포막의 일부이며 단백질이나 지질과 복합체를 형성합니다. 막은 단백질 분자가 부유(또는 고정)되어 일종의 모자이크를 형성하는 이중층으로 구성됩니다.
막의 구조는 그 기능에 해당합니다.운송, 장벽 및 수용체.
1) 장벽 기능.막은 다양한 화학물질과 기타 물질이 세포 안으로 들어가는 것을 막는 장벽입니다.
2) 수용체 기능.막 표면에는 다양한 물질과의 특정 반응을 가능하게 하는 대규모 수용체 세트가 있습니다.
3) 운송 기능.이온과 물질의 이동은 막을 통해 발생합니다.
세포를 덮고 환경으로부터 분리함으로써 생물학적 막은 세포와 소기관의 무결성을 보장합니다. 원형질과 환경 사이에 칼륨, 나트륨, 염소 및 기타 이온의 고르지 않은 분포를 유지합니다.
세포에서 특히 중요한 막은 다음과 같습니다. 플라스마렘마- 표면 막. 이는 장벽, 수송, 수용체 및 신호 전달 기능을 수행합니다.
막을 통한 물질의 수송.
두 가지 활성 프로세스가 있습니다. 세포외유출과 세포내이입.
물질은 다음과 같이 세포에서 제거됩니다. 세포외유출- 세포내 소포와 원형질막의 융합. 물질은 다음을 통해 세포 안으로 들어갈 수 있습니다. 세포내이입.세포내이입 과정에서 원형질막은 오목한 부분을 형성하고 성장한 후 벗겨져 소포 또는 액포로 변합니다.
세포내이입에는 두 가지 유형이 있습니다.
- 음세포증- 작은 기포를 사용하여 액체 및 용해된 물질을 흡수합니다.
- 식균작용- 미생물이나 세포 파편과 같은 큰 입자의 흡수.
식균작용의 경우 큰 거품이 형성되는데 이를 액포.
분자는 단순 확산, 촉진 확산, 능동 수송 과정을 통해 막을 통과합니다.
단순확산- 이것은 분자 농도가 높은 곳에서 농도가 낮은 곳으로 이동하는 수동 수송의 예입니다. 단순 확산을 통해 지질에 용해되는 비극성(소수성) 물질과 전하를 띠지 않는 작은 분자(예: 물)가 세포 안으로 침투합니다. 그러나 대부분의 물질은 막에 내장된 수송 단백질을 사용하여 막을 통해 수송됩니다. 주소에는 두 가지 형태가 있습니다. 확산과 능동수송을 촉진합니다.
확산촉진농도 구배에 의해 결정되고 분자는 이 구배에 따라 움직입니다. 그러나 분자는 전하를 띠고 있으며 그 수송은 농도 구배와 막 전위 모두에 의해 영향을 받습니다.
활동적인 운송 ATP의 에너지를 사용하여 농도 구배에 반하여 용질을 운반하는 것입니다. 물질은 확산에 의해 움직이는 자연스러운 경향과 반대로 반대 방향으로 움직여야 하기 때문에 에너지가 필요합니다. 예를 들어 나트륨-칼륨 펌프가 있습니다. 확산 법칙에 따르면 Na 이온은 끊임없이 세포 안으로 이동하고 K + 이온은 세포 밖으로 이동합니다. 이러한 이온의 필수 농도를 위반하면 세포 사멸이 발생합니다.
세포의 표면 장치.
다양한 원핵 및 진핵 세포는 표면 장치, 세포질, 핵 장치 등의 부분으로 구성됩니다.
표면 장치세포는 모든 유형의 세포에 보편적인 세 가지 기능, 즉 장벽, 수송, 수용체를 수행합니다. 또한 여러 가지 특정 기능(예: 식물 세포 세포벽의 기계적 팽압 기능)을 수행할 수도 있습니다. 세포의 표면 장치는 원형질막, 막상 복합체 및 막하(즉, 막하) 근골격 장치 시스템으로 구성됩니다.
원형질막,또는 Plasmalemma는 모든 세포에 보편적인 표면 장치의 주요 시스템입니다. 그 아래에는 막횡단 수송 및 수용에 관여하고 세포질의 일부인 막하 시스템이 있습니다.
막상 구조표면 장치는 세포와 외부 환경 사이 또는 다른 세포와 상호 작용합니다. 동물 세포에서는 막상 복합체 또는 글리코칼릭스,세포의 수용체 기능에 중요한 역할을 합니다. 글리코칼릭스는 탄수화물로 구성되어 있으며 상대적으로 얇고 탄력이 있습니다.
파생된 상부막 구조에 속합니다. 세포벽.이는 식물, 균류 및 박테리아의 세포에서 생산되어야 합니다. 식물의 세포벽에는 셀룰로오스, 곰팡이 - 키틴, 박테리아 - 무레인이 포함되어 있습니다. 꽤 단단하고 수축되지 않습니다. 물, 염분, 많은 유기 물질의 분자가 세포벽을 통과합니다. 식물 세포의 플라스몰분해 및 탈플라즈마분해 현상.
혈장분해- 이것은 세포가 고장성 상태에 잠겨 있을 때 막에서 세포질이 분리되는 것입니다. 외부에서 농축된 용액. 동물 세포를 고장성 용액에 담그면 수축됩니다. 때로는 혈장분해된 세포가 살아 있는 경우도 있습니다. 이러한 세포를 세포보다 염분 농도가 낮은 물에 담그면 탈혈질 분해가 발생합니다.
탈혈질분해- 이것은 식물 세포의 세포질이 플라스마 분해 상태에서 원래 상태로 되돌아가는 것입니다.
세포학 연구에서는 악성, 양성 종양 및 비종양 병변을 식별하기 위해 세포 구조를 연구합니다. 연구의 주요 목적은 분석을 위해 채취한 세포의 악성 사실을 확인하거나 반박하는 것입니다.
세포학적 연구 방법은 세포 구조, 체액 및 조직의 세포 구성을 현미경으로 연구하는 데 기반을 두고 있습니다.
세포학 연구에는 다음과 같은 방법이 있습니다.
- 광학현미경;
- 전자현미경;
- 원심분리 방법. 일반 구조에서 세포막을 분리해야 할 때 사용됩니다.
- 태그된 원자 방식. 그들은 세포의 생화학적 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 이 목적을 위해 표지된 방사성 동위원소가 세포에 도입됩니다.
- 평생 공부. 이 연구 방법을 사용하면 세포에서 발생하는 동적 과정을 연구할 수 있습니다.
세포학적 연구의 결론은 세포질, 세포핵, 핵-세포질 비율, 복합체 형성 및 세포 구조의 변화 특징을 기반으로 합니다.
세포학적 분석은 예방 검사, 진단 명확화, 수술 중 적시 재발 감지 및 치료 진행 상황 모니터링에 사용됩니다.
도말의 세포학적 검사
분석에는 다음 자료가 사용됩니다.
- 액체: 소변, 전립선 분비물, 가래, 다양한 기관의 내시경 검사 중에 얻은 면봉, 유두 분비물, 궤양 및 침식된 표면의 지문 및 긁힌 자국, 상처 및 누공, 장액 및 관절강의 체액;
- 점상점(punctates): 얇은 바늘로 진단 천자를 시행하는 동안 얻은 생물학적 물질.
- 공동과 자궁 경부에서 번짐.
도말에 대한 이러한 세포학적 연구의 대부분은 필요한 경우 진단을 확립하고 명확하게 하기 위해 수행됩니다. 그러나 자궁경부 도말(Papanicolaou 도말)에 대한 세포학적 검사는 다음과 같이 권장됩니다. 1년에 한 번 - 성적으로 활동적인 19세 이상의 여성의 경우; 1년에 2회 - 호르몬 피임약을 복용하고 생식기 포진이 있었던 여성의 경우; 연 2회 이상 - 불임, 자궁 출혈, 비만으로 고통받는 여성, 성 파트너를 자주 바꾸는 여성, 에스트로겐을 복용하는 여성, 생식기에 사마귀가 있는 여성, 생식기 포진 진단을 받은 여성의 경우.
자궁경부의 세포학적 검사
자궁 경부의 세포학적 검사를 위해 특수 나무 주걱을 사용하여 자궁 경부의 외부 및 내부 부분과 질 둥근 부분에서 도말을 채취합니다. 그런 다음 유리로 옮겨 고정됩니다.
자궁 경부의 세포 학적 검사는 세포의 암성 변화를 확인하기 위해 수행되며 결론적으로 의사는 세포 상태의 5 단계 중 하나를 나타냅니다.
- 1단계. 이상이 있는 세포는 발견되지 않습니다.
- 2 단계. 내부 생식기의 염증으로 인해 세포 구조에 사소한 변화가 있습니다. 이러한 세포 상태는 문제를 일으키지 않지만 여성은 추가 검사와 치료를 받는 것이 좋습니다.
- stage 3. 구조에 이상이 있는 소수의 세포가 발견되었습니다. 이 경우 다시 도말을 받거나 변화된 조직에 대한 조직학적 검사를 실시하는 것이 좋습니다.
- 4단계. 악성 변화가 있는 개별 세포가 발견됩니다. 최종 진단이 이루어지지 않고 추가 검사가 처방됩니다.
- 5단계. 도말검사에서 다수의 암세포가 발견됩니다.
이러한 세포학적 연구의 신뢰성은 높지만 분석을 위해 세포를 채취한 영역에 대한 정보만 제공할 수 있습니다. 나팔관, 난소, 자궁의 상태를 평가하기 위해서는 종합적인 검사를 받아야 합니다.