Metode de cercetare în histologie, citologie și embriologie. Citologia - știința celulelor Metode moderne de cercetare Principala metodă de citologie în studiu

Pentru progresul histologiei, citologiei și embriologiei, este de mare importanță introducerea realizărilor în fizică și chimie, noi metode ale științelor conexe - biochimie, biologie moleculară, inginerie genetică.

Metodele moderne de cercetare fac posibilă studierea țesuturilor nu numai ca un întreg, ci și izolarea tipurilor individuale de celule din ele pentru a studia activitatea lor de viață pe o perioadă lungă de timp, pentru a izola organele celulare individuale și macromoleculele lor constitutive (de exemplu, ADN) și să studieze caracteristicile lor funcționale.

Astfel de oportunități s-au deschis în legătură cu crearea de noi instrumente și tehnologii - diverse tipuri de microscoape, tehnologie computerizată, analiză structurală cu raze X, utilizarea rezonanței magnetice nucleare (RMN), izotopi radioactivi și autoradiografie, electroforeză și cromatografie, fracționare. a conținutului celular folosind ultracentrifugarea, separarea și cultivarea celulelor, producerea de hibrizi; utilizarea metodelor biotehnologice - producerea de hibridoame și anticorpi monoclonali, ADN recombinant etc.

Astfel, obiectele biologice pot fi studiate la nivel de țesut, celular, subcelular și molecular. În ciuda introducerii în științele naturii a unei varietăți de metode biochimice, biofizice, fizice și tehnologice necesare pentru a rezolva multe probleme legate de viața celulelor și țesuturilor, histologia rămâne în mod fundamental o știință morfologică cu propriul set de metode. Acestea din urmă fac posibilă caracterizarea proceselor care au loc în celule și țesuturi și a caracteristicilor lor structurale.

Principalele etape ale analizei citologice și histologice sunt selectarea unui obiect de studiu, pregătirea acestuia pentru examinare la microscop, utilizarea metodelor de microscopie și analiza calitativă și cantitativă a imaginii.

Obiectele cercetării sunt celulele și țesuturile vii și fixe, imaginile acestora obținute la microscoape luminoase și electronice sau pe un ecran de televiziune. Există o serie de metode care vă permit să analizați aceste obiecte.

Metode de microscopie a preparatelor histologice

Principalele metode de studiere a microobiectelor biologice sunt microscopia luminoasă și electronică, care sunt utilizate pe scară largă în practica experimentală și clinică.

Microscopia este principala metodă de studiere a microobiectelor, folosită în biologie de mai bine de 300 de ani. De la crearea și utilizarea primelor microscoape, acestea au fost îmbunătățite constant. Microscoapele moderne sunt o varietate de sisteme optice complexe cu rezoluție înaltă. Dimensiunea celei mai mici structuri care poate fi văzută la microscop este determinată de cea mai mică distanță rezolvabilă (d o ), care depinde în principal de lungimea de undă a luminii (\) și lungimile de undă ale oscilațiilor electromagnetice ale fluxului de electroni etc. Această dependență este determinată aproximativ de formula d 0 = 1 / 2 \. Astfel, cu cât lungimea de undă este mai mică, cu atât distanța rezolvată este mai mică și microstructurile pot fi văzute mai mici în preparat. Pentru studiul preparatelor histologice se folosesc diverse tipuri de microscoape ușoare și microscoape electronice.

Orez. 1. Microscoape pentru cercetare biologică.

A - microscop biologic luminos "Biolam-S": 1 - baza; 2 - suport tub; 3 - tub înclinat; 4 - ocular, 5 - revolver; 6 - lentile; 7 - masa; 8 - condensator cu diafragmă iris; 9 - șurub condensator; 10 - oglinda; 11 - surub micrometric; 12 - șurub macrometric. B - microscop electronic EMV-100AK cu sistem automat de procesare a imaginii: 1 - coloană microscop (cu sistem electron-optic și cameră de probă); 2 - panou de control; 3 - camera cu ecran luminescent; 4 - unitate de analiză a imaginii; 5 - senzor de semnal video.

Microscopie cu lumină. Pentru studiul microobiectelor histologice se folosesc microscoape ușoare convenționale și varietățile acestora, care folosesc surse de lumină cu lungimi de undă diferite. În microscoapele ușoare convenționale, sursa de iluminare este lumina naturală sau artificială (Fig. 1, A). Lungimea de undă minimă a părții vizibile a spectrului este de aproximativ 0,4 µm. Prin urmare, pentru un microscop cu lumină convențional cel mai mic distanța de rezoluție este de aproximativ 0,2 µm ( d o = "/,- 0,4 µm = 0,2 µm), iar mărirea totală (produsul măririi obiectivului și mărirea ocularului) poate fi 1500-2500.

Astfel, într-un microscop cu lumină puteți vedea nu numai celule individuale cu dimensiuni cuprinse între 4 și 150 de microni, ci și structurile lor intracelulare - organite, incluziuni. Pentru a spori contrastul micro-obiectelor, se folosește colorarea acestora.

Microscopia ultravioletă. Acesta este un tip de microscopie ușoară. Un microscop cu ultraviolete folosește raze ultraviolete mai scurte, cu o lungime de undă de aproximativ 0,2 microni. Distanța rezolvată aici este de 2 ori mai mică decât în ​​microscoapele ușoare convenționale și este de aproximativ 0,1 μm (d o = V 2 - 0,2 μm = 0,1 μm). O imagine invizibilă pentru ochi, obținută în raze ultraviolete, este transformată în una vizibilă prin înregistrarea pe o placă fotografică sau prin utilizarea unor dispozitive speciale (ecran fluorescent, convertor electron-optic).

Microscopie fluorescentă (luminiscentă). Fenomenele de fluorescență constau în faptul că atomii și moleculele unui număr de substanțe, absorbind razele de unde scurte, intră într-o stare excitată. Tranziția inversă de la starea excitată la starea normală are loc odată cu emisia de lumină, dar cu o lungime de undă mai mare. Într-un microscop cu fluorescență, lămpile cu mercur sau xenon de ultra-înaltă presiune sunt folosite ca surse de lumină pentru a excita fluorescența, care au luminozitate mare în regiunea spectrală de 0,25-0,4 μm (aproape razele ultraviolete) și 0,4-0,5 μm (raze albastru-violete). razele). Lungimea de undă a luminii fluorescente este întotdeauna mai mare decât lungimea de undă a luminii excitante, astfel încât acestea sunt separate folosind filtre de lumină, iar imaginea obiectului este studiată numai în lumină fluorescentă. Se face o distincție între fluorescența intrinsecă sau primară și indusă sau secundară. Orice celulă a unui organism viu are propria sa fluorescență, dar este adesea extrem de slabă.

Serotonina și catecolaminele (adrenalină, norepinefrină) conținute în celulele nervoase, catarg și alte celule prezintă fluorescență primară după fixarea țesuturilor în vapori de formaldehidă la 60-80 °C (metoda Falck).

Fluorescența secundară apare atunci când medicamentele sunt procesate cu coloranți speciali - fluorocromi.

Există diferiți fluorocromi care se leagă în mod specific la anumite macromolecule (acridină portocalie, rodamină, fluoresceină etc.). De exemplu, fluorocromul de portocaliu acridină este cel mai des folosit la procesarea medicamentelor. În acest caz, ADN-ul și compușii săi din celule sunt de culoare verde strălucitor și ARNși derivații săi - o strălucire roșie strălucitoare. Astfel, compoziția spectrală a radiației poartă informații despre structura internă a obiectului și compoziția chimică a acestuia. O variantă a metodei de microscopie cu fluorescență, în care atât excitația, cât și emisia de fluorescență au loc în regiunea ultravioletă a spectrului, se numește metoda microscopie cu fluorescență ultravioletă.

Microscopie cu contrast de fază. Această metodă este utilizată pentru a obține imagini de contrast ale obiectelor vii transparente și incolore care sunt invizibile cu metodele convenționale de microscopie. După cum sa indicat deja, într-un microscop cu lumină convențional contrastul necesar al structurilor este obținut prin colorare. Metoda contrastului de fază oferă contrast cu structurile nevopsite studiate datorită unei diafragme inelare speciale plasate în condensator și a așa-numitei plăci de fază situată în lentilă. Acest design al opticii microscopului face posibilă transformarea schimbărilor de fază ale luminii care trece printr-un preparat nepătat, care nu sunt percepute de ochi, într-o modificare a amplitudinii sale, de exemplu. luminozitatea imaginii rezultate. Creșterea contrastului vă permite să vedeți toate structurile care diferă în indicele de refracție. O variație a metodei contrastului de fază este metoda contrast fază-câmp întunecat, oferind o imagine de contrast de fază negativă versus pozitivă.

Microscopie în câmp întunecat.Într-un microscop cu câmp întunecat, doar lumina care produce difracția structurilor din specimen ajunge la obiectiv. Acest lucru se întâmplă din cauza prezenței unui condensator special în microscop, care luminează specimenul cu lumină strict oblică; Razele de la iluminator sunt direcționate din lateral. Astfel, câmpul apare întunecat, iar particulele mici din preparat reflectă lumina, care apoi intră în lentilă. Rezoluția acestui microscop nu poate fi mai bună decât cea a unui microscop cu câmp luminos, deoarece este utilizată aceeași lungime de undă. Dar aici se realizează un contrast mai mare. Este folosit pentru a studia obiecte vii, obiecte autorradiografice, cum ar fi boabele de argint, care apar strălucitoare într-un câmp întunecat. În clinică, este folosit pentru a studia cristalele în urină (acid uric, oxalați), pentru a demonstra spirochetele, în special treponema pallidum, care provoacă sifilis etc.

Microscopia de interferență. Varietățile unui microscop cu contrast de fază sunt un microscop de interferență, care este conceput pentru a cuantifica masa țesutului și un microscop de interferență diferențială (cu optică Nomarski), care este utilizat în mod special pentru a studia relieful de suprafață a celulelor și a altor obiecte biologice.

Într-un microscop de interferență, un fascicul de lumină de la un iluminator este împărțit în două fluxuri: unul trece prin obiect și schimbă faza de oscilație, al doilea ocolește obiectul. În prismele obiectivelor, ambele fascicule sunt conectate și interferează între ele. Ca rezultat, se construiește o imagine în care secțiuni ale unui microobiect de grosimi și densități diferite diferă în gradul de contrast. După cuantificarea modificărilor, se determină concentrația și masa substanței uscate.

Microscoapele cu contrast de fază și interferență fac posibilă studierea celulelor vii. Ei folosesc efectul de interferență care apare atunci când două seturi de unde se combină pentru a crea o imagine a microstructurilor. Avantajul microscopiei cu contrast de fază, interferență și câmp întunecat este capacitatea de a observa celulele în procesul de mișcare și mitoză. În acest caz, mișcarea celulei poate fi înregistrată utilizând microfilmare time-lapse (cadru cu cadru).

Microscopia de polarizare. Un microscop polarizant este o modificare a unui microscop luminos în care sunt instalate două filtre polarizante - primul (polarizator) între fascicul de lumină și obiect, iar al doilea (analizator) între lentila obiectiv și ochi. Prin primul filtru, lumina trece într-o singură direcție, al doilea filtru are o axă principală care este perpendiculară pe primul filtru și nu transmite lumină. Acest lucru produce un efect de câmp întunecat. Ambele filtre se pot roti, schimbând direcția fasciculului de lumină. Dacă analizorul este rotit cu 90° față de polarizator, atunci lumina nu va trece prin ele. Structurile care conțin molecule orientate longitudinal (colagen, microtubuli, microfilamente) și structuri cristaline (în celulele Leydig 1) apar ca luminoase atunci când axa de rotație se modifică. Capacitatea cristalelor sau formațiunilor paracristaline de a împărți o undă luminoasă într-o undă obișnuită și una perpendiculară pe aceasta se numește birefringență. Fibrilele mușchilor striați au această capacitate.

Microscopia electronică. Un mare pas înainte în dezvoltarea tehnologiei de microscopie a fost crearea și utilizarea unui microscop electronic (vezi Fig. 1, B). Un microscop electronic folosește un flux de electroni cu lungimi de undă mai scurte decât un microscop cu lumină. La o tensiune de 50.000 V, lungimea de undă a oscilațiilor electromagnetice care apar atunci când un flux de electroni se mișcă în vid este de 0,0056 nm. Se calculează teoretic că distanța rezolvată în aceste condiții poate fi de aproximativ 0,002 nm, sau 0,000002 um, adică de 100.000 de ori mai puțin; decât într-un microscop cu lumină. În practică, în microscoapele electronice moderne, distanța rezolvată este de aproximativ 0,1-0,7 nm.

În prezent, microscoapele electronice cu transmisie (transmisie) (TEM) și microscoapele electronice cu scanare (raster) (SEM) sunt utilizate pe scară largă. Folosind TEM, puteți obține doar o imagine plană a microobiectului studiat. Pentru a obține o reprezentare spațială a structurilor, se folosesc SEM-uri care sunt capabile să creeze o imagine tridimensională. Un microscop electronic de scanare funcționează pe principiul scanării unui obiect studiat cu o microsondă electronică, adică „sondează” secvenţial puncte individuale ale suprafeţei cu un fascicul de electroni puternic focalizat. Pentru a studia o zonă selectată, microsonda se deplasează de-a lungul suprafeței sale sub influența bobinelor de deviere (principiul de scanare a televiziunii). O astfel de examinare a unui obiect se numește scanare (citire), iar modelul de-a lungul căruia se mișcă microsonda se numește raster. Imaginea rezultată este afișată pe un ecran de televiziune, al cărui fascicul de electroni se mișcă sincron cu microsonda.

Principalele avantaje ale microscopiei electronice cu scanare sunt o adâncime mare de câmp, o gamă largă de modificări continue ale măririi (de la zeci la zeci de mii de ori) și rezoluție ridicată.

Microscopia electronică folosind metoda congelarii- ciobirea folosit pentru a studia detaliile structurii membranelor și a conexiunilor intercelulare. Pentru a face chipsuri, celulele sunt înghețate la o temperatură scăzută (-160 °C). La examinarea unei membrane, planul de clivaj trece prin mijlocul stratului dublu lipidic. Apoi, metalele (platină, paladiu, uraniu) sunt pulverizate pe suprafețele interioare ale jumătăților de membrane rezultate și studiate folosind TEM și microfotografie.

Metoda criomicroscopiei electronice. Un strat subțire înghețat rapid (aproximativ 100 nm) dintr-o probă de țesut este plasat pe o rețea microscopică și examinat într-un vid de microscop la -160 C.

Metoda de microscopie electronică „înghețare”- gravare" folosit pentru a studia suprafața exterioară a membranelor celulare. După congelarea rapidă a celulelor la o temperatură foarte scăzută, blocul este despicat cu o lamă de cuțit. Cristalele de gheață rezultate sunt îndepărtate prin sublimarea apei în vid. Apoi zonele celulelor sunt umbrite prin pulverizarea unei pelicule subțiri de metal greu (de exemplu, platină). Metoda face posibilă identificarea organizării tridimensionale a structurilor.

Astfel, metodele de congelare-clivare și congelare-gravare fac posibilă studierea celulelor nefixate fără formarea de artefacte cauzate de fixare.

Metodele contrastante cu sărurile de metale grele fac posibilă examinarea macromoleculelor individuale - ADN, proteine ​​mari (de exemplu, miozina) într-un microscop electronic. Cu contrast negativ, sunt studiate agregatele de macromolecule (ribozomi, virusuri) sau filamente proteice (filamente de actină).

Microscopia electronică a secțiunilor ultrasubțiri obținute prin crio-ultra-microtomie.În această metodă, bucăți de țesut fără fixare sau încorporare în medii solide sunt răcite rapid în azot lichid la o temperatură de -196 °C. Aceasta asigură inhibarea proceselor metabolice celulare și trecerea apei din faza lichidă în faza solidă. În continuare, blocurile sunt tăiate folosind un ultramicrotom la temperatură scăzută. Această metodă de preparare a secțiunilor este utilizată de obicei pentru a determina activitatea enzimatică, precum și pentru a efectua reacții imunochimice. Pentru detectarea antigenelor, se folosesc anticorpi care sunt asociați cu particule de aur coloidal, a căror localizare este ușor de identificat pe preparate.

Metode de microscopie de ultra-înaltă tensiune. Se folosesc microscoape electronice cu o tensiune de accelerare de până la 3.000.000 V Avantajul acestor microscoape este că fac posibilă studierea obiectelor de grosime mare (1-10 microni), deoarece la energii mari de electroni sunt mai puțin absorbite de obiect. . Imagistica stereoscopică permite obținerea de informații despre organizarea tridimensională a structurilor intracelulare cu rezoluție mare (aproximativ 0,5 nm).

Analiza difracției cu raze X. Pentru a studia structura macromoleculelor la nivel atomic, se folosesc metode care utilizează raze X având o lungime de undă de aproximativ 0,1 nm (diametrul unui atom de hidrogen). Moleculele care formează rețeaua cristalină sunt studiate folosind modele de difracție, care sunt înregistrate pe o placă fotografică sub formă de multe puncte de intensitate variabilă. Intensitatea petelor depinde de capacitatea diferitelor obiecte din matrice de a împrăștia radiația. Poziția petelor în modelul de difracție depinde de poziția obiectului în sistem, iar intensitatea lor indică structura atomică internă a acestuia.

Metode pentru studiul celulelor și țesuturilor fixe

Studiul celulelor și țesuturilor fixe. Obiectul principal al studiului este preparate histologice, pregătite din structuri fixe. Proba poate fi un frotiu (de exemplu, un frotiu de sânge, măduvă osoasă, salivă, lichid cefalorahidian etc.), o amprentă (de exemplu, splină, timus, ficat), o peliculă de țesut (de exemplu, conjunctiv sau peritoneu, pleura, pia mater) , felie subtire. Cel mai adesea, o secțiune de țesut sau organ este folosită pentru studiu. Preparatele histologice pot fi studiate fără prelucrare specială. De exemplu, un frotiu de sânge pregătit, o imprimare, un film sau o secțiune de organ poate fi examinat imediat la microscop. Dar datorită faptului că structurile au un contrast scăzut, ele sunt slab vizibile într-un microscop cu lumină convențională și este necesară utilizarea de microscoape speciale (contrast de fază etc.) Prin urmare, sunt mai des utilizate preparate special prelucrate.

Procesul de realizare a unei pregătiri histologice pentru microscopia luminoasă și electronică include următoarele etape principale: 1) preluarea materialului și fixarea acestuia, 2) compactarea materialului, 3) pregătirea secțiunilor, 4) colorarea sau contrastarea secțiunilor. Pentru microscopia cu lumină, este necesar un alt pas - includerea secțiunilor în balsam sau alte medii transparente (5). Fixare asigură prevenirea proceselor de descompunere, ceea ce ajută la menținerea integrității structurilor. Acest lucru se realizează prin faptul că o mică probă prelevată din organ este fie scufundată într-un fixativ (alcool, formaldehidă, soluții de săruri de metale grele, acid osmic, amestecuri speciale de fixare), fie supusă unui tratament termic. Sub influența fixativului, în țesuturi și organe apar modificări fizice și chimice complexe. Cel mai semnificativ dintre ele este procesul de coagulare ireversibilă a proteinelor, în urma căruia activitatea vitală încetează, iar structurile devin moarte și fixate. Fixarea conduce la compactarea și reducerea volumului pieselor, precum și la o îmbunătățire a colorării ulterioare a celulelor și țesuturilor.

Compactarea pieselor necesar pentru pregătirea secțiunilor, este produs prin impregnarea materialului deshidratat anterior cu parafină, celoidină și rășini organice. Compactarea mai rapidă se realizează prin utilizarea metodei de congelare a pieselor, de exemplu în dioxid de carbon lichid.

Pregatirea sectiunilor produs pe dispozitive speciale - microtomi(pentru microscopie ușoară) și ultramicrotoame(pentru microscopia electronică).

Colorarea secțiunii(în microscopie cu lumină) sau stropindu-le cu saruri metalice(în microscopia electronică) sunt folosite pentru a crește contrastul imaginii structurilor individuale atunci când le vizionați la microscop. Metodele de colorare a structurilor histologice sunt foarte diverse și sunt selectate în funcție de obiectivele studiului. Petele histologice sunt împărțite în acide, bazice și neutre. Un exemplu este cel mai faimos colorant de bază, azur II, care colorează nucleii violet, și colorantul acid eozină, care colorează citoplasma roz-portocaliu. Afinitatea selectivă a structurilor pentru anumiți coloranți este determinată de compoziția lor chimică și de proprietățile fizice. Se numesc structuri care se colorează bine cu coloranți acizi oxifil(acidofile, eozinofile), și cele colorate cu cele de bază - bazofilă. Structurile care acceptă atât coloranții acizi cât și bazici sunt neutrofil(heterofil). Preparatele colorate sunt de obicei deshidratate în alcooli cu putere crescândă și limpezite în xilen, benzen, toluen sau unele uleiuri. Pentru conservarea pe termen lung, secțiunea histologică deshidratată este închisă între o lamă și o sticlă de acoperire în balsam de Canada sau alte substanțe. Eșantionul histologic finit poate fi utilizat pentru studiu la microscop timp de mulți ani. Pentru microscopia electronică, secțiunile obținute cu ultramicrotom sunt așezate pe grile speciale, contrastate cu sărurile de mangan, cobalt etc., după care sunt privite la microscop și fotografiate. Microfotografiile rezultate servesc ca obiect de studiu împreună cu preparatele histologice.

Metode pentru studiul celulelor și țesuturilor vii

Studiul celulelor și țesuturilor vii ne permite să obținem cele mai complete informații despre activitatea lor de viață - să urmărim mișcarea, procesele de diviziune, distrugere, creștere, diferențiere și interacțiune a celulelor, durata ciclului lor de viață, modificările reactive ca răspuns. la acţiunea diverşilor factori.

Studii intravitale ale celulelor din organism (învivo). Una dintre metodele de cercetare intravitale este observarea structurilor dintr-un organism viu. Folosind microscoape cu iluminare cu transmisie speciale, de exemplu, este posibil să se studieze dinamica circulației sângelui în microvase. După administrarea anesteziei animalului, obiectul de studiu (de exemplu, mezenterul intestinal) este scos și examinat la microscop, în timp ce țesutul trebuie umezit constant cu soluție izotonică de clorură de sodiu. Cu toate acestea, durata unei astfel de observații este limitată. Cele mai bune rezultate sunt obținute prin metoda de implantare a camerelor transparente în corpul animalului.

Cel mai convenabil organ pentru implantarea unor astfel de camere și observarea ulterioară este urechea unui animal (de exemplu, un iepure). O secțiune a urechii cu o cameră transparentă este plasată pe o plată de microscop și în aceste condiții se studiază dinamica modificărilor în celule și țesuturi pe o perioadă lungă de timp. În acest fel, pot fi studiate procesele de evacuare a leucocitelor din vasele de sânge, diferitele etape ale formării țesutului conjunctiv, capilarelor, nervilor și alte procese. Ochiul animalelor de experiment poate fi folosit ca o cameră naturală transparentă. Probele de celule, țesut sau organe sunt plasate în fluidul camerei anterioare a ochiului la unghiul format de cornee și iris și pot fi văzute prin corneea limpede. În acest fel, un ou fertilizat a fost transplantat și au fost urmărite etapele incipiente ale dezvoltării embrionului. Bucăți mici de uter au fost transplantate în maimuțe și au fost studiate modificările mucoasei uterine în diferite faze ale ciclului menstrual.

Metoda de transplant de celule sanguine și măduvă osoasă de la animale donatoare sănătoase la animalele primitoare expuse la radiații letale a găsit o utilizare pe scară largă. Animalele primitoare au rămas în viață după transplant datorită grefei celulelor donatoare, care au format colonii de celule hematopoietice în splină. Studierea numărului de colonii și a compoziției lor celulare face posibilă identificarea numărului de celule hematopoietice părinte și a diferitelor etape ale diferențierii lor. Folosind metoda de formare a coloniilor, au fost identificate sursele de dezvoltare pentru toate celulele sanguine.

Colorație vitală și supravitală.În colorarea vitală (intravitală) a celulelor și țesuturilor, colorantul este introdus în corpul animalului și colorează selectiv anumite celule, organitele lor sau substanța intercelulară. De exemplu, fagocitele sunt detectate folosind albastru tripan sau carmin de litiu, iar matricea osoasă nou formată este detectată folosind alizarina.

Colorația supravitală este colorarea celulelor vii izolate din organism. În acest fel, sunt identificate forme tinere de eritrocite - reticulocite sanguine (colorant albastru cresil diamant), mitocondrii în celule (colorant verde Janus), lizozomi (colorant roșu neutru).

Studii ale celulelor și țesuturilor vii în cultură (învitro). Această metodă este una dintre cele mai comune. Celulele, mostrele mici de țesut sau organele izolate din corpul uman sau animal sunt plasate în vase de sticlă sau plastic care conțin un mediu nutritiv special - plasmă sanguină, extract embrionar, precum și medii artificiale. Există culturi în suspensie (celule suspendate într-un mediu), culturi de țesut, de organe și monostrat (celulele explantate formează un strat continuu pe sticlă). Se asigura sterilitatea mediului si temperatura corespunzatoare temperaturii corpului. În aceste condiții, celulele păstrează pentru o lungă perioadă de timp semnele vitale de bază - capacitatea de a crește, de a se reproduce, de a se diferenția și de a se mișca. Astfel de culturi pot exista multe zile, luni și chiar ani dacă mediul de cultură este actualizat și celulele viabile sunt transplantate în alte vase. Unele tipuri de celule, datorită modificărilor genomului lor, pot supraviețui și se pot multiplica în cultură, formând linii celulare continue. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky, F. M. Lazarenko au avut o mare contribuție la dezvoltarea metodelor de cultivare a celulelor și țesuturilor. În prezent, s-au obținut linii celulare de fibroblaste, miocite, celule epiteliale, macrofage etc., care există de mulți ani.

Utilizarea metodei de cultivare a făcut posibilă identificarea unui număr de modele de diferențiere, degenerare malignă a celulelor, interacțiuni celulare și interacțiuni ale celulelor cu viruși și microbi. Au fost demonstrate capacitatea celulelor cartilajului de a forma substanță intercelulară în cultură și capacitatea celulelor suprarenale de a produce hormoni. Cultivarea țesuturilor și organelor embrionare a făcut posibilă urmărirea dezvoltării oaselor, pielii și a altor organe. A fost dezvoltată o tehnică de cultivare a celulelor nervoase.

Metoda culturii de țesuturi este de o importanță deosebită pentru efectuarea de observații experimentale asupra celulelor și țesuturilor umane. Celulele prelevate din corpul uman în timpul puncției sau biopsiei pot fi utilizate în cultura de țesut pentru a determina sexul, bolile ereditare, degenerarea malignă și pentru a detecta efectele unui număr de substanțe toxice.

În ultimii ani, culturile celulare au fost utilizate pe scară largă pentru hibridizarea celulară.

Au fost dezvoltate metode pentru împărțirea țesuturilor în celule, izolarea tipurilor individuale de celule și cultivarea acestora.

În primul rând, țesutul este transformat într-o suspensie celulară prin distrugerea contactelor intercelulare și a matricei intercelulare folosind enzime proteolitice (tripsină, colagenază) și compuși de legare a Ca 2+ (folosind EDTA - acid etilendiaminotetraacetic). Apoi, suspensia rezultată este împărțită în fracții de celule de diferite tipuri prin centrifugare, ceea ce face posibilă separarea celulelor mai grele de cele ușoare, a celor mari de cele mici sau prin aderarea celulelor la sticlă sau plastic, a căror capacitate variază între diferite tipuri de celule. Pentru a asigura aderența specifică a celulelor la suprafața de sticlă, sunt utilizați anticorpi care se leagă în mod specific la celulele de un tip. Celulele aderente sunt apoi separate prin distrugerea matricei cu enzime, rezultând o suspensie de celule omogene. O metodă mai subtilă de separare a celulelor este marcarea cu anticorpi asociați cu coloranți fluorescenți. Celulele marcate sunt separate de celulele nemarcate folosind un sortator (analizor de celule activat prin fluorescență electronică). Analizorul de celule sortează aproximativ 5000 de celule în 1. Celulele izolate pot fi studiate în condiții de cultură.

Metoda de cultivare a celulelor face posibilă studierea activității lor vitale, reproducere, diferențiere, interacțiune cu alte celule, influența hormonilor, factorilor de creștere etc.

Culturile sunt de obicei preparate dintr-o suspensie celulară obţinută prin metoda de disociere a ţesuturilor descrisă mai sus. Majoritatea celulelor nu pot crește în suspensie, necesită o suprafață solidă, care este suprafața unui vas de cultură din plastic, uneori cu componente ale matricei extracelulare, cum ar fi colagenul. Culturi primare se numesc culturi preparate imediat după prima etapă de fracţionare celulară, secundar- culturi celulare transplantate din culturi primare într-un mediu nou. Celulele pot fi transplantate succesiv pe o perioadă de săptămâni sau luni, celulele păstrându-și trăsăturile caracteristice de diferențiere (de exemplu, celulele epiteliale formând straturi). Materialul de plecare pentru culturile celulare este de obicei țesuturi fetale și nou-născute.

Amestecuri de săruri, aminoacizi, vitamine, ser de cal, extract de embrion de pui, ser fetal etc. sunt folosite ca medii nutritive. Medii speciale au fost acum dezvoltate pentru cultivarea diferitelor tipuri de celule. Acestea conțin unul sau mai mulți factori de creștere proteici necesari pentru funcționarea și reproducerea celulelor. De exemplu, factorul de creștere a nervilor (NGF) este necesar pentru creșterea celulelor nervoase.

Majoritatea celulelor din cultură suferă un anumit număr de diviziuni (50-100) și apoi mor. Uneori, în cultură apar celule mutante, care se înmulțesc la nesfârșit și formează o linie celulară (fibroblaste, celule epiteliale, mioblaste etc.). Celulele mutante diferă de celulele canceroase, care sunt, de asemenea, capabile de diviziune continuă, dar pot crește fără a se atașa de o suprafață solidă. Celulele canceroase din vasele de cultură formează o populație mai densă decât populațiile de celule normale. O proprietate similară poate fi indusă experimental în celulele normale prin transformarea lor cu virusuri sau compuși chimici derivați din tumori, ceea ce are ca rezultat formarea liniilor celulare transformate neoplazic. Liniile celulare de celule netransformate și transformate pot fi stocate pentru o lungă perioadă de timp la temperaturi scăzute (-70 ° C). Omogenitatea genetică a celulelor este îmbunătățită prin clonare, atunci când dintr-o celulă se obține o colonie mare de celule omogene în timpul diviziunii sale secvențiale. O clonă este o populație de celule derivate dintr-o singură celulă progenitoare.

Hibrizi celulari. Când două celule de tipuri diferite se unesc, se formează un heterocarion - o celulă cu doi nuclei. Pentru a obține un heterocarion, o suspensie celulară este tratată cu polietilen glicol sau viruși inactivați pentru a deteriora membranele plasmatice ale celulelor, după care celulele sunt capabile de fuziune. De exemplu, nucleul inactiv al unui eritrocit de pui devine activ (sinteza ARN, replicarea ADN-ului) la fuziunea celulelor și transferul în citoplasma unei alte celule care crește în cultura de țesut. Heterocarionul este capabil de mitoză, ducând la formare celulă hibridă.Învelișurile nucleelor ​​heterocarionului sunt distruse, iar cromozomii lor sunt combinați într-un singur nucleu mare.

Clonarea celulelor hibride duce la formarea liniilor celulare hibride, care sunt utilizate pentru studiile genomului. De exemplu, într-o linie celulară hibridă șoarece-om, a fost stabilit rolul cromozomului 11 uman în sinteza insulinei.

Hibridoame. Liniile celulare de hibridom sunt folosite pentru a produce anticorpi monoclonali. Anticorpii sunt produși de celulele plasmatice, care sunt formate din limfocitele B în timpul imunizării. Un anumit tip de anticorp este obținut prin imunizarea șoarecilor cu antigeni specifici. Dacă astfel de limfocite imunizate sunt donate, se poate obține un număr mare de anticorpi omogene. Cu toate acestea, durata de viață a limfocitelor B în cultură este limitată. Prin urmare, ele fuzionează cu celule tumorale „nemuritoare” (limfoame B). Ca rezultat, se formează hibrizi (celula hibrida, cu un genom din două celule diferite; oma - care se termină cu numele de tumori). Astfel de hibridoame sunt capabile să se înmulțească pentru o lungă perioadă de timp în cultură și să sintetizeze anticorpi de un anumit tip. Fiecare clonă de hibridom este o sursă de anticorpi monoclonali. Toate moleculele de anticorpi de un anumit tip au aceeași specificitate de legare a antigenului. Este posibil să se obțină anticorpi monoclonali împotriva oricărei proteine ​​​​conținute într-o celulă și să le folosească pentru a determina localizarea proteinelor în celulă, precum și pentru a izola proteinele dintr-un amestec (purificarea proteinelor), ceea ce permite studierea structurii și funcției. a proteinelor. Anticorpii monoclonali sunt, de asemenea, utilizați în tehnologia clonării genelor.

Anticorpii pot fi utilizați pentru a studia funcția diferitelor molecule prin introducerea lor prin plasmalemă direct în citoplasma celulelor cu o pipetă de sticlă subțire. De exemplu, introducerea de anticorpi la miozină în citoplasma unui ou fecundat de arici de mare oprește diviziunea citoplasmei.

Tehnologia ADN recombinant. Metodele genetice clasice fac posibilă studierea funcției genelor prin analiza fenotipurilor organismelor mutante și a descendenților acestora. Tehnologia ADN-ului recombinant completează aceste metode, permițând analiza chimică detaliată a materialului genetic și producerea de proteine ​​celulare în cantități mari.

Metodele de hibridizare sunt utilizate pe scară largă în biologia modernă pentru a studia structura genelor și expresia lor.

Metode de studiere a compoziției chimice și a metabolismului celulelor și țesuturilor

Pentru a studia compoziția chimică a structurilor biologice - localizarea substanțelor, concentrația și dinamica lor în procesele metabolice, se folosesc metode speciale de cercetare.

cito-Şi metode histochimice. Aceste metode fac posibilă identificarea localizării diferitelor substanțe chimice în structurile celulelor, țesuturilor și organelor - ADN, ARN, proteine, carbohidrați, lipide, aminoacizi, minerale, vitamine, activitate enzimatică. Aceste metode se bazează pe specificitatea reacției dintre un reactiv chimic și un substrat care face parte din structurile celulare și tisulare și pe colorarea produselor reacțiilor chimice. Pentru a crește specificitatea reacției, este adesea folosit control enzimatic. De exemplu, pentru a detecta acidul ribonucleic (ARN) în celule, este adesea folosită galocianina, un colorant cu proprietăți de bază și prezența ARN confirmată prin tratamentul de control cu ​​ribonuclează, care scindează ARN-ul. Pete de galocianina ARNîn culoarea albastru-violet. Dacă secțiunea este pretratată cu ribonuclează și apoi colorată cu galocianină, atunci absența colorării confirmă prezența acidului ribonucleic în structură. Descrierile numeroaselor metode cito- și histochimice sunt date în manuale speciale.

În ultimii ani, combinarea metodelor histochimice cu microscopia electronică a condus la dezvoltarea unei noi direcții promițătoare - histochimia electronică. Această metodă face posibilă studierea localizării diferitelor substanțe chimice nu numai la nivel celular, ci și la nivel subcelular și molecular.

Pentru a studia macromoleculele celulelor, se folosesc metode foarte sensibile folosind izotopi și anticorpi radioactivi, care fac posibilă detectarea chiar și a unei cantități mici de molecule (mai puțin de 1000).

Izotopi radioactivi Când se degradează, nucleele emit particule încărcate (electroni) sau radiații (de exemplu, raze gamma), care pot fi detectate în instrumente speciale. Izotopii radioactivi sunt utilizați în metoda autoradiografiei. De exemplu, cu ajutorul radioizotopilor de 3 H-timidină se studiază ADN-ul nucleului, cu ajutorul 3H-uridinei - ARN.

Metoda autoradiografiei. Această metodă face posibilă studierea cât mai completă a metabolismului în diferite structuri. Metoda se bazează pe utilizarea elementelor radioactive (de exemplu, fosfor - 32 P, carbon - 14 C, sulf - 35 S, hidrogen - 3 H) sau compuși marcați cu acestea. Substanțele radioactive din secțiuni histologice sunt detectate folosind o emulsie fotografică, care este aplicată pe preparat și apoi dezvoltată. În zonele medicamentului în care fotoemulsia intră în contact cu o substanță radioactivă, are loc o fotoreacție, în urma căreia se formează zone iluminate (urme). Această metodă poate fi utilizată pentru a determina, de exemplu, viteza de încorporare a aminoacizilor marcați în proteine, formarea acizilor nucleici, metabolismul iodului în celulele tiroidiene etc.

Metode de analiză prin imunofluorescență. Aplicarea anticorpilor. Anticorpii sunt proteine ​​protectoare produse de plasmocite (derivați ai limfocitelor B) ca răspuns la acțiunea unor substanțe străine (antigene). Numărul de diferite forme de anticorpi ajunge la un milion. Fiecare anticorp are locuri pentru „recunoașterea” moleculelor care au determinat sinteza acestui anticorp. Datorită specificității ridicate a anticorpilor pentru antigene, aceștia pot fi utilizați pentru a detecta orice proteine ​​celulare. Pentru a dezvălui localizarea proteinelor, anticorpii sunt colorați cu coloranți fluorescenți, iar apoi celulele sunt examinate folosind microscopie cu fluorescență. Anticorpii pot fi folosiți și pentru a studia antigenele la nivel ultrastructural folosind un microscop electronic. Pentru a face acest lucru, anticorpii sunt etichetați cu particule dense de electroni (microsfere de aur coloidal). Pentru a spori specificitatea reacției, se folosesc anticorpi monoclonali, formați dintr-o linie celulară - clone obținute prin metoda hibridomului dintr-o celulă. Metoda hibridomului permite obținerea de anticorpi monoclonali cu aceeași specificitate și în cantități nelimitate.

Metodele de analiză imunofluorescente sunt utilizate pe scară largă și eficient în histologia modernă. Aceste metode sunt folosite pentru a studia procesele de diferențiere celulară și pentru a identifica compuși chimici specifici și structurile din acestea. Ele se bazează pe reacții antigen-anticorp. Fiecare celulă a corpului are o compoziție antigenică specifică, care este determinată în principal de proteine. Produșii de reacție pot fi colorați și detectați într-un microscop cu fluorescență, de exemplu, detectarea actinei și tubulinei într-o celulă folosind metoda imunofluorescenței (vezi capitolul IV).

Metodele moderne de cercetare fac posibilă analiza compoziției chimice a diferitelor componente structurale ale celulelor, atât fixe, cât și vii. Studiul structurilor intracelulare individuale a devenit posibil după dezvoltarea tehnologiilor de fracţionare a conţinutului celular.

Fracționarea conținutului celular

Structurile celulare și macromoleculele pot fi fracționate folosind diverse metode - ultracentrifugare, cromatografie, electroforeză. Aceste metode sunt descrise mai detaliat în manualele de biochimie.

Ultracentrifugarea. Folosind această metodă, celulele pot fi împărțite în organele și macromolecule. În primul rând, celulele sunt distruse de șoc osmotic, ultrasunete sau acțiune mecanică. În acest caz, membranele (plasmolema, reticulul endoplasmatic) se dezintegrează în fragmente, din care se formează vezicule minuscule, iar nucleii și organitele (mitocondrii, aparatul Golgi, lizozomi și peroxizomi) rămân intacte și se află în suspensia formată.

Pentru a separa componentele celulei de mai sus, se folosește o centrifugă de mare viteză (80.000-150.000 rpm). În primul rând, părți mai mari (nuclei, citoschelet) se depun (sedimentul) în partea de jos a eprubetei. Odată cu o creștere suplimentară a vitezei de centrifugare a fracțiilor supernatante, particulele mai mici se stabilesc secvenţial - mai întâi mitocondriile, lizozomii și peroxizomii, apoi microzomii și veziculele minuscule și, în final, ribozomii și macromoleculele mari. În timpul centrifugării, diferite fracțiuni se depun la viteze diferite, formând benzi separate în eprubetă care pot fi izolate și examinate. Extractele celulare fracționate (sisteme fără celule) sunt utilizate pe scară largă pentru a studia procesele intracelulare, de exemplu, pentru a studia biosinteza proteinelor, descifrarea codului genetic etc.

Cromatografia este utilizată pe scară largă pentru fracţionarea proteinelor.

Electroforeza permite separarea moleculelor de proteine ​​cu diferite sarcini prin plasarea lor în soluții apoase (sau într-o matrice solidă poroasă) într-un câmp electric.

Metodele de cromatografie și electroforeză sunt utilizate pentru a analiza peptidele obținute prin divizarea unei molecule de proteine ​​și pentru a obține așa-numitele hărți peptidice ale proteinelor. Aceste metode sunt descrise în detaliu în manualele de biochimie.

Studiul compoziției chimice a celulelor vii. Pentru a studia distribuția substanțelor și metabolismul lor în celulele vii, se folosesc metode de rezonanță magnetică nucleară și tehnologia microelectrodului.

Rezonanța magnetică nucleară (RMN) permite studiul moleculelor mici de substanțe cu greutate moleculară mică. O probă de țesut conține atomi în diferite molecule și în diferite medii, astfel încât va absorbi energie la frecvențe de rezonanță diferite. Diagrama de absorbție la frecvențele de rezonanță pentru o probă dată va fi spectrul acesteia RMN.În biologie, semnalul RMN de la protoni (nuclei de hidrogen) este utilizat pe scară largă pentru a studia proteinele, acizii nucleici etc. Pentru a studia macromoleculele din interiorul unei celule vii, izotopii 3 H, 13 C, 35 K, 31 R sunt adesea utilizați pentru a obține Semnalează RMN și monitorizează modificările acesteia în timpul vieții celulei. Deci, 3| P este folosit pentru a studia contracția musculară - modificări ale conținutului de ATP și fosfat anorganic din țesuturi. Izotopul 13 C face posibilă studierea multor procese în care este implicată glucoza folosind RMN. Utilizarea RMN este limitată de sensibilitatea sa scăzută: 1 g de țesut viu trebuie să conțină cel puțin 0,2 mm din substanța studiată. Avantajul metodei este că este inofensivă pentru celulele vii.

Tehnologia cu microelectrozi. Microelectrozii sunt tuburi de sticlă umplute cu o soluție conductoare de electricitate (de obicei o soluție de KS1 în apă), al cărei diametru se măsoară în fracțiuni de micron. Vârful unui astfel de tub poate fi introdus în citoplasma celulei prin plasmalemă și se poate determina concentrația ionilor H + , Na + , K + , C1 ", Ca 2+ , Mg 2+, diferența de potențial de-a lungul plasmalemei. , și, de asemenea, injectați molecule în celulă Pentru a determina concentrația unui ion specific, se folosesc electrozi ion-selectivi, care sunt umpluți cu o rășină schimbătoare de ioni, permeabilă doar la un ion dat, tehnologia microelectrodului a fost folosit pentru a studia transportul ionilor prin canale ionice speciale (canale proteice specializate) în membrana plasmatică. Această metodă vă permite să studiați funcția unei singure molecule de proteine. Modificările în concentrația de ioni în interiorul celulei pot fi determinate folosind indicatori luminiscenți, de exemplu, pentru a studia concentrația intracelulară de Ca 2+, proteina luminiscentă meduze) care emite lumină în prezenţa ionilor de Ca 2+ şi răspunde la modificările concentraţiei acestora din urmă în intervalul 0,5-10 µM. Au fost sintetizați și indicatori fluorescenți care se leagă puternic de Ca 2+. Crearea diferitelor tipuri noi de indicatori intracelulari și a metodelor moderne de analiză a imaginii face posibilă determinarea cu precizie și rapiditate a concentrației intracelulare a multor substanțe cu molecularitate scăzută.

Metode cantitative

În prezent, alături de metodele calitative, au fost dezvoltate și utilizate metode histochimice cantitative pentru a determina conținutul diferitelor substanțe din celule și țesuturi. Particularitatea metodelor de cercetare histochimice cantitative (spre deosebire de biochimice) este posibilitatea de a studia concentrația și conținutul componentelor chimice în structurile specifice ale celulelor și țesuturilor.

Citospectrofotometrie- o metodă pentru studiul cantitativ al substanțelor intracelulare pe baza spectrului lor de absorbție.

Citospectrofluorimetria- o metodă de studiu cantitativ al substanțelor intracelulare prin spectrele lor de fluorescență sau intensitatea fluorescenței la o lungime de undă preselectată (citofluorimetrie).

Microscoape moderne - citofluorimetre fac posibilă detectarea unor cantități mici de substanță în diferite structuri (până la 10~14 -10~16 g) și evaluarea localizării substanțelor studiate în microstructuri.

Metode de analiză a imaginilor structurilor celulare și tisulare

Imaginile rezultate ale microobiectelor într-un microscop, pe un ecran de televiziune sau în micrografiile electronice pot fi supuse unei analize speciale - identificarea parametrilor morfometrici, densitometrici și procesarea lor statistică.

Metode morfometrice vă permit să determinați cu ajutorul unor grile speciale (E. Weibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanov) numărul oricăror structuri, zonele, diametrele acestora etc. În special, în celule, zonele nucleelor, citoplasmei, diametrele lor pot fi relații măsurate, nuclearo-citoplasmatice etc. Există morfometrie manuală și morfometrie automată, în care toți parametrii sunt măsurați și înregistrați automat în aparat.

În ultimii ani, acestea au devenit din ce în ce mai răspândite automatizaresisteme de procesare a imaginilor (AIS), permițând implementarea cât mai eficientă a metodelor cantitative de mai sus pentru studiul celulelor și țesuturilor. În același timp, capacitățile analitice ale microscopiei cantitative sunt completate de metode de analiză și recunoaștere a probelor bazate pe prelucrarea informațiilor extrase din imaginile celulelor și țesuturilor folosind computere electronice. În esență, putem vorbi despre dispozitive care nu numai că îmbunătățesc capacitățile optice ale analizorului vizual uman, dar și își extind foarte mult capacitățile analitice. Se sugerează că ACOI face aceeași revoluție în morfologie care a avut loc în urmă cu aproximativ 300 de ani datorită invenției microscopului luminos și cu aproximativ 50 de ani în urmă - microscopul electronic, deoarece nu numai că măresc nemăsurat productivitatea cercetătorului și nu. doar obiectivează observațiile, dar permit și obținerea de noi informații despre procese nedetectate anterior, modelează numeric și prezic dezvoltarea lor în celule și țesuturi.

În același timp, participarea la un experiment pe calculator presupune ca cercetătorul să aibă o nouă abordare a implementării acestuia, să posede abilitățile de a elabora algoritmi pentru procesul de cercetare, acuratețea raționamentului și, în cele din urmă, să crească nivelul științific și metodologic. a cercetării.

Una dintre metodele care a extins semnificativ numărul de probleme morfologice care pot fi rezolvate este analiza mașinii opto-structurale (OSMA), propusă în 1965 de K.M. În 1978, autorul metodei a fost distins cu Premiul de Stat al URSS. Odată cu apariția OSMA, a fost făcut un pas calitativ nou în dezvoltarea unei metodologii unificate pentru analiza cantitativă a microstructurilor bazată pe caracteristici statistice. Recent, OSMA a găsit o aplicare eficientă în practica cercetării și în economia națională.

În fig. În figura 2 este prezentat sistemul automat de procesare a imaginilor Protva-MP creat în țara noastră de compania LOMO. Sistemul este conceput pentru studii complexe ale celulelor și țesuturilor folosind metode de absorbție, microscopie cu fluorescență și autoradiografie.

Un microscop optic sau electronic cu scanare special inclus în sistem efectuează vizualizarea secvențială a imaginii medicamentului de-a lungul a două coordonate, transformând-o în formă digitală și o introduce într-un computer, care, la rândul său, efectuează procesarea imaginilor digitale și oferă informații despre geometria. și alte caracteristici ale obiectului analizat.

Folosind un afișaj color, un cercetător poate „diseca” o imagine, evidențiind doar acele componente structurale care îl interesează. Dispozitivele de stocare a informațiilor încăpătoare pe discuri sau benzi magnetice incluse în computer fac posibilă stocarea atât a imaginilor în sine, cât și a rezultatelor prelucrării lor pentru stocarea și documentarea ulterioară.

Să luăm în considerare utilizarea metodelor de analiză automată a micro-obiectelor folosind exemplul de procesare a unei imagini a unui leucocit de sânge (Figura 3) Un microscop-fotometru de scanare vă permite să „vizualizați” valorile densității optice linie cu linie cu o etapă specificată de cercetător Ca urmare, semnalul optic corespunzător densității optice a obiectului este convertit în formă digitală Matricea digitală rezultată supusă pregătirii cu ajutorul unui aparat matematic special.

Mai întâi, fundalul este îndepărtat și un obiect „pur” este izolat - imaginea unei celule (1a), apoi orice detaliu de interes pentru cercetător este izolat din imaginea celulei, de exemplu, citoplasma (16) și nucleul (I). ordonați valoarea medie și integrală a densității optice, dispersie, asimetrie, kurtoză etc. Din imaginea obiectului se obțin parametri morfometrici: aria, perimetrul, diametrul, raportul nuclear-citoplasmatic, coeficientul de formă etc.

Următoarea etapă a procesării imaginii este construirea de diagrame bidimensionale a interdependenței densității optice pentru întreaga celulă (vezi Fig. 3), citoplasma (Shb) și nucleul acesteia (Shv). diagrama întregii celule (Sha) se poate distinge faza citoplasmatică și sâmburi Aceste diagrame vă permit să calculați parametrii histogramei de ordinul doi: omogenitate, contrast local, entropie etc.

Orez. H. Procesarea automată a imaginii celulare (diagrama).

Imaginea unui leucocite (a), a citoplasmei sale (b) și a nucleului (c). I - imagine digitală; II - histograme de densitate optică; III - histograme bidimensionale ale dependenței valorilor densității optice.

Parametrii obținuți în acest fel reprezintă un „portret” multidimensional al celulei și au o expresie numerică specifică. Ele pot fi supuse diferitelor metode de prelucrare statistică, permițând clasificarea extrem de precisă a micro-obiectelor, identificând caracteristicile structurii lor care sunt nedetectabile vizual.

Astfel, utilizarea noilor metode de cercetare în histologie, citologie și embriologie face posibilă clarificarea tiparelor generale de organizare a țesuturilor și celulelor, baza structurală a proceselor biochimice care determină funcția componentelor structurale specifice ale celulei.

Etape principale în dezvoltarea citologiei

Istoria descoperirii celulei

Citologia („cytos” - celulă, celulă) este știința celulelor. Studii moderne de citologie: structura celulelor, formarea lor ca sisteme vii elementare, studiază formarea componentelor celulare individuale, procesele de reproducere celulară, reparare, adaptare la condițiile de mediu și alte procese. Cu alte cuvinte, citologia modernă este fiziologia celulei.

Dezvoltarea studiului celulei este strâns legată de invenția microscopului (din grecescul „micros” - mic, „skopeo” - mă uit). Acest lucru se datorează faptului că ochiul uman este incapabil să distingă obiectele mai mici de 0,1 mm, adică 100 de micrometri (abreviați microni sau µm). Dimensiunile celulelor (și chiar mai mult, structurile intracelulare) sunt semnificativ mai mici.

De exemplu, diametrul unei celule animale nu depășește, de obicei, 20 de microni, o celulă de plante - 50 de microni și lungimea cloroplastei unei plante cu flori - nu mai mult de 10 microni. Folosind un microscop cu lumină, puteți distinge obiecte cu un diametru de zecimi de micron.

Primul microscop a fost proiectat în 1610 de Galileo și a fost o combinație de lentile într-un tub de plumb (Fig. 1.1).Și înainte de această descoperire în 1590, maeștrii olandezi Jansens erau angajați în producția de sticlă.

Orez. 1.1. Galileo Galilei (1564-1642)

Fizicianul și naturalistul englez R. Hooke a fost primul care a folosit un microscop pentru cercetare. (Fig. 1.2, 1.4).În 1665, el a descris pentru prima dată structura celulară a plutei și a inventat termenul de „celulă”. (Fig. 1.3). R. Hooke a făcut prima încercare de a număra numărul de celule dintr-un anumit volum al unui dop.

El a formulat ideea unei celule ca o celulă, complet închisă pe toate părțile și a stabilit faptul că structura celulară a țesuturilor plantelor. Aceste două concluzii principale au determinat direcția cercetărilor ulterioare în acest domeniu.

Orez. 1.2. Robert Hooke (1635-1703)

Orez. 1.3. Celulele de plută studiate de Robert Hooke

Orez. 1.4. Microscop Robert Hooke

În 1674, comerciantul olandez Antonio van Leeuwenhoek, folosind un microscop, a văzut pentru prima dată „animale” într-o picătură de apă - organisme vii în mișcare (organisme unicelulare, celule sanguine, spermatozoizi) și a raportat acest lucru comunității științifice. (Fig. 1.5, 1.6). Descrierile acestor „animalcus” i-au câștigat olandezului faima mondială și au trezit interesul pentru studiul microlumii vii.

Orez. 1.5. Antonio van Leeuwenhoek (1632-1723)

Orez. 1.6. Microscop de Antonio van Leeuwenhoek

În 1693, în timpul șederii lui Petru I la Delphi, A. Leeuwenhoek i-a demonstrat cum se mișcă sângele în înotătoarea unui pește. Aceste demonstrații au făcut o impresie atât de mare asupra lui Petru I, încât, la întoarcerea în Rusia, a creat un atelier de instrumente optice. În 1725, a fost organizată Academia de Științe din Sankt Petersburg.

Maeștri talentați I.E. Belyaev, I.P. Kulibin a făcut microscoape (Fig. 1.7, 1.8, 1.9), la proiectarea căreia au participat academicienii L. Euler și F. Epinus.

Orez. 1.7. I.P. Kulibin (1735-1818)

Orez. 1.8. I.E. Belyaev

Orez. 1.9. Microscoape realizate de meșteri ruși

În 1671–1679 Biologul și medicul italian Marcello Malpighi a oferit prima descriere sistematică a microstructurii organelor plantelor, care a pus bazele anatomiei plantelor. (Fig. 1.10).

Orez. 1.10. Marcello Malpighi (1628-1694)

În 1671–1682 englezul Nehemiah Grew a descris în detaliu microstructurile plantelor; a introdus termenul „țesut” pentru a se referi la conceptul de colecție de „bule” sau „pungi” (Fig. 1.11). Ambii cercetători (au lucrat independent unul de celălalt) au oferit descrieri și desene uimitor de precise. Au ajuns la aceeași concluzie cu privire la universalitatea construcției țesutului vegetal din vezicule.

Orez. 1.11. Neemia a crescut (1641-1712)

În anii 20 ai secolului al XIX-lea. Cele mai semnificative lucrări din domeniul studierii țesuturilor vegetale și animale aparțin oamenilor de știință francezi Henri Dutrochet (1824), Francois Raspail (1827), Pierre Turpin (1829). Ei au demonstrat că celulele (saci, vezicule) sunt structurile elementare ale tuturor țesuturilor vegetale și animale. Aceste studii au deschis calea pentru descoperirea teoriei celulare.

Unul dintre fondatorii embriologiei și anatomiei comparate, academicianul Academiei de Științe din Sankt Petersburg Karl Maksimovici Baer a arătat că celula este o unitate nu numai a structurii, ci și a dezvoltării organismelor. (Fig. 1.12).

Orez. 1.12. K.M. Baer (1792-1876)

În 1759, anatomistul și fiziologul german Caspar Friedrich Wolf a demonstrat că celula este o unitate de creștere. (Fig. 1.13).

Orez. 1.13. K.F. Lupul (1733–1794)

anii 1830 Fiziologul și anatomistul ceh J.E. Purkyne (Fig. 1.14), biologul german I.P. Muller a demonstrat că organizarea celulară este universală pentru toate tipurile de țesuturi.

Orez. 1.14. Da.E. Purkyne (1787-1869)

În 1833, botanistul britanic R. Brown (Fig. 1.15) a descris nucleul unei celule vegetale.

Orez. 1.15. Robert Brown (1773-1858)

În 1837, Matthias Jacob Schleiden (Fig. 1.16) a propus o nouă teorie a formării celulelor vegetale, recunoscând rolul decisiv al nucleului celular în acest proces. În 1842 a descoperit pentru prima dată nucleoli în nucleu.

Potrivit ideilor moderne, studiile specifice ale lui Schleiden conțineau o serie de erori: în special, Schleiden credea că celulele ar putea apărea din materie fără structură, iar embrionul de plantă se poate dezvolta dintr-un tub polen (ipoteza generării spontane a vieții).

Orez. 1.16. Matthias Jacob Schleiden (1804-1881)

Citolog, histolog și fiziolog german Theodor Schwann (Fig. 1.17) a făcut cunoştinţă cu lucrările botanistului german M. Schleiden, care a descris rolul nucleului într-o celulă vegetală. Comparând aceste lucrări cu propriile sale observații, Schwann și-a dezvoltat propriile principii de structură celulară și dezvoltare a organismelor vii.

În 1838, Schwann a publicat trei rapoarte preliminare ale teoriei celulare, iar în 1839, lucrarea „Studii microscopice privind corespondența în structura și creșterea animalelor și plantelor”, unde a publicat principiile de bază ale teoriei structurii celulare a organisme vii.

F. Engels a susținut că crearea teoriei celulare a fost una dintre cele mai mari trei descoperiri ale științelor naturale ale secolului al XIX-lea, alături de legea transformării energiei și teoria evoluționistă.

Orez. 1.17. Theodor Schwann (1810-1882)

În 1834–1847 Profesor al Academiei Medico-Chirurgicale din Sankt Petersburg P.F. Goryaninov (Fig. 1.18) a formulat principiul conform căruia celula este un model universal de organizare a fiinţelor vii.

Goryaninov a împărțit lumea ființelor vii în două regnuri: regnul fără formă, sau molecular, și regnul organic sau celular. El a scris că „... lumea organică este în primul rând un regn celular...”. El a remarcat în studiile sale că toate animalele și plantele constau din celule interconectate, pe care le-a numit vezicule, adică și-a exprimat o opinie despre structura generală a plantelor și animalelor.

Orez. 1.18. P.F. Goryaninov (1796-1865)

În istoria dezvoltării teoriei celulare, se pot distinge două etape:

1) perioada de acumulare a observațiilor asupra structurii diferitelor organisme unicelulare și pluricelulare ale plantelor și animalelor (aproximativ 300 de ani);

2) perioada de generalizare a datelor disponibile în 1838 și formularea postulatelor teoriei celulare;

Universitatea Tehnică de Stat din Murmansk

Departamentul de Biologie

Raport pe subiect:

„Metode de cercetare în citologie”

Finalizat:

student anul 1

Facultatea de Tehnologie

Departamentele Biologie

Serebryakova Lada Viaceslavovna

Verificat:

Murmansk2001

Plan:

1.Ce studiază citologia?

2.Ideea că organismele constau din celule.

3. Metode de cercetare utilizate în citologie.

4. Fracționarea celulară.

5. Autoradiografie.

6. Determinarea duratei unor etape ale ciclului celular prin autoradiografie.

Citologia este știința celulelor. A apărut din alte științe biologice acum aproape 100 de ani. Pentru prima dată, informații generalizate despre structura celulelor au fost colectate într-o carte a lui J.-B. Carnoy's Biology of the Cell, publicată în 1884. Citologia modernă studiază structura celulelor, funcționarea lor ca sisteme vii elementare: funcțiile componentelor celulare individuale, procesele de reproducere celulară, repararea lor, adaptarea la condițiile de mediu și multe alte procese sunt studiate, permițând să judece proprietățile și funcțiile. comun tuturor celulelor. Citologia ia în considerare și caracteristicile structurale ale celulelor specializate. Cu alte cuvinte, citologia modernă este fiziologia celulei. Citologia este strâns legată de realizările științifice și metodologice ale biochimiei, biofizicii, biologiei moleculare și geneticii. Aceasta a servit drept bază pentru un studiu aprofundat al celulei din punctul de vedere al acestor științe și apariția unei anumite științe sintetice a celulei - biologia celulară, sau biologia celulară. În prezent, termenii citologie și biologie celulară coincid, deoarece subiectul lor de studiu este celula cu propriile modele de organizare și funcționare. Disciplina „Biologie celulară” se referă la secțiunile fundamentale ale biologiei, deoarece studiază și descrie singura unitate a întregii vieți de pe Pământ – celula.

Un studiu lung și atent al celulei ca atare a condus la formularea unei importante generalizări teoretice de semnificație biologică generală și anume apariția teoriei celulare. În secolul al XVII-lea Robert Hooke, un fizician și biolog de mare ingeniozitate, a creat un microscop Examinând o secțiune subțire de plută la microscop, Hooke a descoperit că era format din celule goale mici separate de pereți subțiri, care, după cum știm acum, constau din celuloză. . El a numit aceste celule mici celule. Mai târziu, când alți biologi au început să examineze țesuturile vegetale la microscop, s-a dovedit că celulele mici descoperite de Hooke într-un dop mort, ofilit erau prezente și în țesuturile vegetale vii, dar în ele nu erau goale, ci fiecare conținea câte un corp gelatinos mic. După ce țesuturile animale au fost supuse examinării microscopice, s-a constatat că acestea constau și din corpuri gelatinoși mici, dar că aceste corpuri sunt doar rareori separate între ele prin pereți. Ca urmare a tuturor acestor studii, în 1939, Schleiden și Schwann în mod independent a formulat teoria celulară, care afirmă că celulele sunt unitățile elementare din care sunt construite în cele din urmă toate plantele și toate animalele. De ceva vreme, sensul dublu al cuvântului celulă a provocat încă unele neînțelegeri, dar apoi s-a stabilit ferm în aceste mici corpuri asemănătoare jeleuului.

Conceptul modern de celule este strâns legat de progresele tehnice și de îmbunătățirea metodelor de cercetare. Pe lângă microscopia cu lumină convențională, care nu și-a pierdut rolul, microscopia de polarizare, ultravioletă, fluorescență și contrast de fază au câștigat o importanță deosebită în ultimele decenii. Printre acestea, microscopia electronică ocupă un loc special, a cărei rezoluție a făcut posibilă pătrunderea și studierea structurii submicroscopice și moleculare a celulei. Metodele moderne de cercetare au făcut posibilă dezvăluirea unei imagini detaliate a organizării celulare.

Fiecare celulă este formată dintr-un nucleu și citoplasmă, separate între ele și de mediul extern prin membrane. Componentele citoplasmei sunt: ​​membrana, hialoplasma, reticulul endoplasmatic si ribozomii, aparatul Golgi, lizozomii, mitocondriile, incluziunile, centrul celular, organitele specializate.

O parte a unui organism care îndeplinește o funcție specială se numește organ. Orice organ - plămân, ficat, rinichi, de exemplu - fiecare are propria sa structură specială, datorită căreia joacă un anumit rol în organism. În același mod, există structuri speciale în citoplasmă, a căror structură particulară le permite să îndeplinească anumite funcții necesare pentru metabolismul celulei; Aceste structuri se numesc organele („organe mici”).

Elucidarea naturii, funcției și distribuției organelelor citoplasmatice a devenit posibilă numai după dezvoltarea metodelor de biologie celulară modernă. Cele mai utile în acest sens au fost: 1) microscopia electronică; 2) fracționarea celulară, cu ajutorul căreia biochimiștii pot izola fracții relativ pure de celule care conțin anumite organite și, astfel, pot studia reacțiile metabolice individuale de interes pentru acestea; 3) autoradiografia, care a făcut posibilă studierea directă a reacțiilor metabolice individuale care apar în organele.

Metoda prin care organelele sunt izolate din celule se numește fracționare. Această metodă s-a dovedit a fi foarte fructuoasă, dând biochimiștilor posibilitatea de a izola diferite organele celulare într-o formă relativ pură. În plus, permite determinarea compoziției chimice a organitelor și a enzimelor pe care le conțin și, pe baza datelor obținute, să tragă concluzii despre funcțiile lor în celulă. Ca prim pas, celulele sunt distruse prin omogenizare într-un mediu adecvat, ceea ce asigură siguranța organelelor și previne agregarea acestora. Foarte des, se folosește o soluție de zaharoză. Deși mitocondriile și multe alte organite celulare rămân intacte, structurile membranare, cum ar fi reticulul endoplasmatic și membrana plasmatică, se dezintegrează în fragmente. Cu toate acestea, fragmentele de membrană rezultate se închid adesea pe ele însele, rezultând vezicule rotunde de diferite dimensiuni.

În etapa următoare, omogenatul celular este supus unei serii de centrifugări, a căror viteză și durata crește de fiecare dată; acest proces se numește centrifugare diferențială. Pe fundul tuburilor de centrifugare sunt depuse diferite organele celulare la diferite viteze de centrifugare, care depinde de mărimea, densitatea și forma organelelor. Precipitatul rezultat poate fi colectat și examinat. Structurile mai mari, mai dense, cum ar fi nucleele, sunt cele mai rapide de așezare, în timp ce structurile mai mici și mai puțin dense, cum ar fi veziculele reticulului endoplasmatic, necesită rate mai mari pentru cel mai lung timp pentru a se sedimenta. Prin urmare, la viteze mici de centrifugare, nucleele sunt sedimentate, în timp ce alte organite celulare rămân în suspensie. La viteze mai mari, mitocondriile și lizozomii precipită, iar cu centrifugare prelungită și viteze foarte mari, chiar și particule mici precum ribozomii precipită. Precipitatele pot fi examinate folosind un microscop electronic pentru a determina puritatea fracțiilor rezultate. Toate fracțiile sunt într-o oarecare măsură contaminate cu alte organite. Dacă, totuși, este posibil să se obțină o puritate suficientă a fracțiilor, acestea sunt apoi supuse analizei biochimice pentru a determina compoziția chimică și activitatea enzimatică a organitelor izolate.

Mai recent, a fost creată o altă metodă de fracţionare a celulelor - centrifugarea cu gradient de densitate; în acest caz, centrifugarea se efectuează într-o eprubetă în care soluțiile de zaharoză cu o concentrație tot mai mare și, prin urmare, cu o densitate crescândă, sunt mai întâi stratificate una peste alta. În timpul centrifugării, organelele conținute în omogenat sunt amplasate într-un tub de centrifugă la nivelurile la care se află soluțiile de zaharoză, corespunzătoare acestora ca densitate. Această metodă oferă biochimiștilor posibilitatea de a separa organele de aceeași dimensiune, dar de densități diferite (Fig. 1.).

Autoradiografia este o metodă relativ nouă, care a extins enorm capacitățile atât ale microscopiei luminoase, cât și ale microscopiei electronice. Aceasta este o metodă extrem de modernă, datorită dezvoltării fizicii nucleare, care a făcut posibilă obținerea de izotopi radioactivi ai diferitelor elemente. Autoradiografia necesită, în special, izotopi ai acelor elemente care sunt utilizate de celulă sau care se pot lega de substanțe utilizate de celulă și care pot fi administrate animalelor sau adăugate la culturi în cantități care nu perturbă metabolismul celular normal. Deoarece un izotop radioactiv (sau substanța marcată cu acesta) participă la reacțiile biochimice în același mod ca omologul său neradioactiv și, în același timp, emite radiații, calea izotopilor în organism poate fi urmărită folosind diferite metode de detectare. radioactivitate. O modalitate de a detecta radioactivitatea se bazează pe capacitatea sa de a acționa asupra filmului fotografic precum lumina; dar radiația radioactivă pătrunde în hârtia neagră folosită pentru a proteja pelicula de lumină și are asupra peliculei același efect ca și lumina.

Pentru a detecta radiațiile emise de izotopii radioactivi pe preparatele destinate studiului cu ajutorul microscoapelor cu lumină sau electronică, preparatele sunt acoperite într-o cameră întunecată cu o emulsie fotografică specială și apoi lăsate pentru ceva timp în întuneric. Apoi preparatele sunt dezvoltate (tot la întuneric) și fixate. Zonele medicamentului care conțin izotopi radioactivi afectează emulsia de bază, în care „boabe” întunecate apar sub influența radiațiilor emise. Astfel, se obțin radioautografe (în greacă. radio– radiază, autoturisme– el însuși și grapho- scrie).

La început, histologii aveau doar câțiva izotopi radioactivi; de exemplu, multe studii de autoradiografie timpurie au folosit fosfor radioactiv. Ulterior, au fost folosiți mai mulți dintre acești izotopi; Izotopul radioactiv al hidrogenului, tritiul, a găsit o utilizare deosebit de răspândită.

Autoradiografia a fost și este încă folosită pe scară largă pentru a studia unde și cum apar anumite reacții biochimice în organism.

Compușii chimici marcați cu izotopi radioactivi care sunt utilizați pentru studiul proceselor biologice se numesc precursori Precursorii sunt de obicei substanțe similare cu cele pe care organismul le obține din alimente. ele servesc ca blocuri de construcție pentru construcția țesuturilor și sunt încorporate în componente complexe ale celulelor și țesuturilor în același mod în care blocurile de construcție neetichetate sunt încorporate în ele. Componenta de țesut în care este încorporat precursorul marcat și care emite radiații se numește produs.

Celulele crescute în cultură, deși aparțin aceluiași tip, se vor afla în stadii diferite ale ciclului celular la un moment dat, cu excepția cazului în care sunt luate măsuri speciale pentru a-și sincroniza ciclurile. Cu toate acestea, prin introducerea de tritiu-timidină în celule și, ulterior, realizarea de autoradiografii, este posibilă determinarea duratei diferitelor etape ale ciclului. Momentul de apariție a unei etape - mitoza - poate fi determinat fără timidină marcată. Pentru a face acest lucru, o probă de celule din cultură este ținută sub observație într-un microscop cu contrast de fază, ceea ce face posibilă monitorizarea directă a progresului mitozei și determinarea momentului acesteia. Durata mitozei este de obicei de 1 oră, deși în unele tipuri de celule durează până la 1,5 ore.

Definiţia durationG2-perioada.

Pentru a determina durata perioadei G 2, o metodă cunoscută ca etichete puls: Timidina marcată este adăugată la cultura celulară și, după un timp scurt, mediul de cultură este înlocuit cu unul proaspăt pentru a preveni absorbția ulterioară a timidinei marcate de către celule. În acest caz, eticheta este inclusă numai în acele celule care, pe parcursul unei scurte ședințe într-un mediu cu tritiu-timidină, au fost în perioada S a ciclului celular. Proporția acestor celule este mică și doar o mică parte a celulelor va primi eticheta. În plus, toate celulele care includ eticheta vor fi în interfază - de la celulele care abia au intrat în perioada S până la cele care aproape au terminat-o în timpul expunerii la tritiu-timidină. În proba prelevată imediat după îndepărtarea timidinei marcate, eticheta este conținută numai în nucleele de interfază aparținând celulelor care au fost în perioada S în perioada de expunere la etichetă; acele celule care au fost în stare de mitoză în această perioadă rămân neetichetate.

Dacă apoi continuați să prelevați probe din cultură la anumite intervale și să pregătiți o autoradiografie pentru fiecare probă succesivă, atunci va veni un moment când eticheta începe să apară în mitoticăd-cromozomi. Etichetele vor fi incluse în toate acele celule care au fost în perioada S în timpul prezenței tritiu-timidinei în mediu, iar printre aceste celule se vor număra cele care tocmai au intrat în perioada S și cele care aproape au terminat-o. Este destul de evident că acestea din urmă vor fi primele dintre celulele marcate care vor suferi mitoză și, prin urmare, eticheta va fi detectată în cromozomii lor mitotici. Astfel, intervalul dintre 1) momentul în care timidina marcată a fost îndepărtată din cultură și 2) momentul apariției cromozomilor mitotici marcați va corespunde cu durata perioadei G 2 a ciclului celular.

Definiţia durationS-perioadă.

Deoarece celulele care se află la sfârșitul perioadei S în momentul introducerii etichetei în mediu vor fi primele care intră în mitoză, prin urmare, în acele celule în care perioada S începe imediat înainte ca eticheta să fie îndepărtată. , cromozomii mitotici marcați vor apărea ultimii. Prin urmare, dacă am putea determina intervalul dintre momentul intrării în mitoză a celulelor marcate primele și celulele marcate ultimele, am stabili durata perioadei S. Cu toate acestea, deși momentul în care apar pentru prima dată cromozomii mitotici marcați este ușor de determinat, momentul la care ultimele celule marcate intră în mitoză nu poate fi determinat (acest lucru este îngreunat de numărul foarte mare de celule în diviziune marcate din ultimele probe). Prin urmare, durata perioadei S trebuie determinată într-un mod diferit.

Când se examinează autoradiografiile probelor succesive de celule prelevate la intervale egale de timp, se descoperă că proporția de celule care poartă marcajul în cromozomii lor mitotici crește treptat până când literalmente toate celulele care se divid sunt etichetate. Cu toate acestea, pe măsură ce celulele termină mitoza una câte una, ele devin celule de interfază marcate. Primele care completează mitoza sunt cele ale celulelor marcate care au intrat primele în ea; și, în consecință, dintre celulele cu cromozomi mitotici marcați, ultimele care au terminat mitoza sunt cele care au intrat în ea mai târziu decât toate. Deoarece durata mitozei este întotdeauna aceeași, atunci, așadar, dacă am putea determina intervalul dintre: 1) momentul sfârșitului mitozei în celulele care au activat mai întâi marcajul și 2) momentul sfârșitului mitoza în celulele care au activat marcajul ultima, am stabili durata perioadei S Durata S- Perioada poate fi stabilită cu ușurință prin determinarea intervalului dintre: 1) momentul în care 50% din. celulele mitotice din cultură sunt nemarcate și 2) momentul după care cultura nu mai conține 50% din celulele marcate.

Determinarea timpului de generare (durata totală a întregului ciclu celular).

Continuând să prelevați probe de celule din cultură, puteți constata că la un moment dat figurile mitotice marcate dispar complet și apoi apar din nou. Astfel de celule de divizare sunt celule fiice derivate din acele celule mamă care au activat eticheta în timp ce se aflau în perioada S în momentul expunerii la tritiu-timidină. Aceste celule mamă au intrat în perioada S, s-au divizat și apoi au trecut printr-o a doua interfază și o a doua diviziune, adică au trecut printr-un ciclu complet și o parte din următorul. Timpul necesar pentru a finaliza un ciclu celular complet se numește timp generaţie. Ea corespunde intervalului dintre două vârfuri succesive de includere a etichetei și de obicei corespunde intervalului dintre acele puncte de curbe ascendente succesive în care 50% din figurile mitotice conțin eticheta.

Literatură.

A. Ham, D. Cormack „Histologie”, volumul 1 Moscova „MIR” 1982;

M.G. Abramov „Citologie clinică” Moscova „MEDICINĂ” 1974;

Y.S.Chentsov „Citologie generală”

Nivelul celular al organizării vieții

§ 16. Istoria studiului celulelor. Metode de cercetare citologică.

Istoria studiului celulelor.

Lumea celulelor a rămas complet necunoscută până la mijlocul secolului al XVII-lea, când oamenii au învățat să șlefuiască lentilele și să le folosească pentru a îmbunătăți vederea.

Unul dintre primii creatori ai microscopului a fost Robert Hooke fizician, meteorolog, biolog, inginer, arhitect. ÎN 1665 a publicat un album de desene numit „macrografie”, care prezenta observațiile sale la microscop.

Unul dintre contemporanii talentați ai lui Hooke a fost olandezul Anthony van Leeuwenhoek, care a creat 200 de microscoape cu design special propriu. Leeuwenhoek a obținut o creștere de 270 de ori a numărului de obiecte și a făcut descoperiri remarcabile.

Robert Brown în 1833 a descoperit nucleul unei celule. După 1825 Jan Purkinje a dezvoltat metode eficiente de pregătire și colorare a preparatelor pentru echipamente microscopice.

Teoria celulară propusă pentru plante în 1837 botanist german Matthias Schleiden,și a fost extins în lumea animală de către prietenul său, fiziologul Theodor Schwann. Puțin mai târziu a fost completat Rudolf Virchow, care în 1885 a formulat propoziția „Fiecare celulă provine dintr-o celulă”.

La mijlocul secolului al XIX-lea. teoria celulară a devenit general acceptată și baza pentru știința celulară - citologie. Până la sfârșitul secolului al XIX-lea. au fost descoperite multe componente ale celulelor. Oamenii de știință le-au descris și le-au dat nume.

Dar în 1945 citologii au cercetat celulele pentru prima dată folosind un microscop electronic și au văzut multe structuri necunoscute anterior. Deci, rolul decisiv în dezvoltarea citologiei revine noilor descoperiri din alte științe, în special din fizică.

Metode de cercetare citologică.

Metoda principală este metoda microscopiei luminoase. Implică utilizarea unui microscop cu lumină, dar numai preparatele citologice special preparate pot fi examinate la microscop cu lumină.

Pentru pregătirea preparatelor, citologii folosesc lame de sticlă și obiecte special pregătite care pot fi examinate.

Cel mai adesea, aceste structuri sunt incolore, așa că trebuie vopsite cu coloranți speciali, diferiți de fiecare dată, în funcție de ce structuri doriți să vedeți.

Există două metode: o metodă de preparare a preparatelor sub presiune - obiectul studiat este pur și simplu zdrobit într-un singur strat între o lamă și o sticlă de acoperire și o metodă de preparare a secțiunilor subțiri constând dintr-un singur strat de celule.

Folosit pentru a studia celulele vii metoda microscopiei cu contrast de fază. Se bazează pe faptul că secțiunile individuale ale unei celule transparente diferă unele de altele în densitate și refracție a luminii.

Când studiază celulele vii, ele folosesc și metoda microscopiei cu fluorescență. Semnificația sa constă în faptul că o serie de substanțe au capacitatea de a străluci atunci când absorb energia luminoasă. De exemplu, dacă te uiți la celulele plantei printr-un microscop fluorescent, atunci pe corpul albastru închis vei vedea boabe roșii care strălucesc puternic - acestea sunt cloroplaste.

Există o metodă care utilizează izotopi etichetați - metoda autoradiografiei- înregistrarea substanţelor etichetate cu izotopi. Folosind această metodă, puteți vedea ce părți ale celulei primesc substanțe marcate cu izotopi radioactivi.

Metoda microscopiei electronice Citologul a descoperit acele structuri celulare care au dimensiuni mai mici decât lungimea de undă a luminii. Datorită acestei metode, a devenit posibilă examinarea virușilor și organitelor pe care are loc sinteza proteinelor (ribozomi).

De asemenea, citologii pot obține și studia diferite componente ale celulelor folosind fracţionarea celulelor. Celula este mai întâi distrusă, iar apoi structurile celulare sunt izolate folosind un dispozitiv special - o centrifugă.

Metoda culturii celulare este o metodă de depozitare și cultivare pe termen lung în medii nutritive speciale a celulelor, țesuturilor, organelor mici sau părților acestora izolate de corpul uman, animal sau vegetal. Un avantaj important al acestei metode este capacitatea de a observa activitatea vitală a celulelor folosind un microscop.

Importanța metodelor citologice în diagnosticul și tratamentul bolilor umane.

1) Metode citologice sunt folosite în medicină pentru a studia starea fiziologică a corpului uman pe baza studierii structurii celulelor. Sunt folosite pentru a identifica bolile de sânge, recunoașterea tumorilor maligne și benigne, a multor boli ale sistemului respirator, digestiei, urinare, sistemului nervos și tratarea acestora.

2) Celula stem este o celulă imatură capabilă de auto-reînnoire și dezvoltare în celule specializate ale corpului. În corpul adult, celulele stem se găsesc în principal în măduva osoasă și în cantități foarte mici în toate organele și țesuturile. Ele pot fi folosite pentru a trata multe boli.

§ 17. Structura celulelor procariote şi eucariote.

Unitatea structurii celulare.

Conținutul oricărei celule este separat de mediul extern printr-o structură specială - membrana plasmatica (plasmalema). Această izolare vă permite să creați un mediu cu totul special în interiorul celulei, spre deosebire de ceea ce o înconjoară. Prin urmare, procesele care nu au loc altundeva pot avea loc în celulă; procesele vieții.

Mediul intern al unei celule vii, delimitat de membrana plasmatică, se numește citoplasmă. Acesta include hialoplasma(substanță transparentă de bază) și organele celulare, precum și diverse structuri nepermanente - incluziuni. Organelele care sunt prezente în orice celulă includ, de asemenea ribozomi, unde se întâmplă sinteza proteinelor.

Structura celulelor eucariote.

eucariote- Acestea sunt organisme ale căror celule au un nucleu. Miez- acesta este chiar organelul celulei eucariote în care se stochează informația ereditară înregistrată în cromozomi și din care se transcrie informațiile ereditare. Cromozom este o moleculă de ADN integrată cu proteine. Miezul contine nucleol- locul unde se formează alte organite importante implicate în sinteza proteinelor - ribozomi. Dar ribozomii se formează doar în nucleu și funcționează (adică sintetizează proteine) în citoplasmă. Unele dintre ele sunt libere în citoplasmă, iar altele sunt atașate de membrane, formând o rețea, care se numește endoplasmatic.

Ribozomi- organele nemembranare.

Reticulul endoplasmatic este o rețea de tubuli mărginiți de membrană. Există două tipuri: netede și granulare. Ribozomii sunt localizați pe membranele reticulului endoplasmatic granular, astfel încât proteinele sunt sintetizate și transportate acolo. Și reticulul endoplasmatic neted este locul sintezei și transportului carbohidraților și lipidelor. Nu există ribozomi pe el.

Sinteza proteinelor, carbohidraților și grăsimilor necesită energie, care este produsă în celula eucariotă de „stațiile energetice” ale celulei - mitocondriile.

Mitocondriile- organele cu membrană dublă în care are loc procesul de respirație celulară. Compușii organici sunt oxidați pe membranele mitocondriale și energia chimică se acumulează sub formă de molecule speciale de energie (ATP).

Există, de asemenea, un loc în celulă unde se pot acumula compuși organici și de unde pot fi transportați - acesta este aparatul Golgi, sistem de pungi cu membrană plate. Este implicat în transportul proteinelor, lipidelor și carbohidraților. Aparatul Golgi produce, de asemenea, organele pentru digestia intracelulară - lizozomi.

Lizozomi- organele cu o singură membrană, caracteristice celulelor animale, conțin enzime care pot descompune proteinele, carbohidrații, acizii nucleici și lipidele.

O celulă poate conține organele care nu au o structură de membrană, cum ar fi ribozomi și un citoschelet.

Citoscheletul- acesta este sistemul musculo-scheletic al celulei, include microfilamente, cili, flageli, centrul celular, care produce microtubuli si centrioli.

Există organite caracteristice doar celulelor vegetale - plastide. Există: cloroplaste, cromoplaste și leucoplaste. Procesul de fotosinteză are loc în cloroplaste.

De asemenea, în celulele vegetale vacuole- produse reziduale ale celulei, care sunt rezervoare de apă și compuși dizolvați în ea. Organismele eucariote includ plante, animale și ciuperci.

Structura celulelor procariote.

procariote- organisme unicelulare ale căror celule nu au nucleu.

Celulele procariote sunt de dimensiuni mici și stochează material genetic sub forma unei molecule circulare de ADN (nucleoid). Organismele procariote includ bacteriile și cianobacteriile, care anterior erau numite alge albastre-verzi.

Dacă procesul de respirație aerobă are loc la procariote, atunci se folosesc proeminențe speciale ale membranei plasmatice pentru aceasta - mezosomi. Dacă bacteriile sunt fotosintetice, atunci procesul de fotosinteză are loc pe membranele fotosintetice - tilacoizi.

Sinteza proteinelor la procariote are loc la ribozomi. Celulele procariote au puține organite.

Ipotezele originii organelelor celulelor eucariote.

Celulele procariote au apărut pe Pământ mai devreme decât celulele eucariote.

1) ipoteza simbiotică explică mecanismul de apariție a unor organite ale celulei eucariote – mitocondriile și plastidele fotosintetice.

2) Ipoteza de invaginație- afirmă că originea celulei eucariote provine din faptul că forma ancestrală a fost o procariotă aerobă. Organelele din el au apărut ca urmare a invaginării și detașării unor părți ale cochiliei, urmată de specializarea funcțională în nucleu, mitocondrii, cloroplaste ale altor organite.

§ 18. Membrane celulare. Transportul substanțelor prin membrane. Aparatul de suprafață al celulei, funcțiile sale.

Membrane celulare.

Membrane biologice- acestea sunt structuri subțiri adiacente de dimensiuni moleculare situate pe suprafața celulelor și a părților subcelulare, precum și a tubilor și veziculelor care pătrund în protoplasmă. Funcția membranelor biologice este de a regla transportul ionilor, zaharurilor, aminoacizilor și altor produse metabolice.

Baza oricărei membrane este un strat dublu de fosfolipide.

Cu toate acestea, stratul bilipid nu este o membrană gata făcută, ci doar baza sa. Proteine ​​numite proteine ​​membranare. Proteinele membranare sunt cele care determină multe dintre proprietățile membranelor. Carbohidrații fac, de asemenea, parte din membrane și formează complexe cu proteine ​​sau lipide. Membrana constă dintr-un strat bilipid în care moleculele de proteine ​​plutesc (sau sunt fixate), formând în ea un fel de mozaic.

Structura membranei corespunde funcțiilor sale: transport, barieră și receptor.

1) Funcția de barieră. Membrana este o barieră care împiedică intrarea diferitelor substanțe chimice și a altor agenți în celule.

2) Funcțiile receptorului. Suprafața membranei are un set mare de receptori care fac posibile reacții specifice cu diverși agenți.

3) Funcția de transport. Transportul ionilor și al substanțelor are loc prin membrană.

Prin acoperirea celulei și separând-o de mediu, membranele biologice asigură integritatea celulelor și organelelor. Menține o distribuție neuniformă a ionilor de potasiu, sodiu, clor și alți ioni între protoplasmă și mediu.

O membrană deosebit de importantă în celulă este plasmalema- membrana de suprafata. Îndeplinește funcții de barieră, transport, receptor, semnalizare.

Transportul substanțelor prin membrane.

Există două procese active: exocitoză și endocitoză.

Substanțele sunt îndepărtate din celulă prin exocitoză- fuziunea veziculelor intracelulare cu membrana plasmatică. Substanțele pot intra în celulă prin endocitoza.În timpul procesului de endocitoză, membrana plasmatică formează concavități și crește, care apoi se desprind și se transformă în vezicule sau vacuole.

Există două tipuri de endocitoză:

- Pinocitoza- absorbția substanțelor lichide și dizolvate folosind bule mici;

- Fagocitoză- absorbția particulelor mari, cum ar fi microorganismele sau resturile celulare.

În cazul fagocitozei se formează bule mari, care se numesc vacuole.

Moleculele trec prin membrane prin procesele: difuzie simplă, difuzie facilitată, transport activ.

Difuziune simplă- Acesta este un exemplu de transport pasiv, trecerea dintr-o zonă cu o concentrație mai mare de molecule într-o zonă cu o concentrație mai mică. Prin difuzie simplă, substanțele nepolare (hidrofobe) solubile în lipide și molecule mici neîncărcate (de exemplu, apă) pătrund în celulă. Cu toate acestea, majoritatea substanțelor sunt transportate prin membrană folosind proteine ​​de transport încorporate în aceasta. Există două forme de adresare: difuzie facilitată și transport activ.

Difuzare facilitată este determinată de un gradient de concentrație, iar moleculele se mișcă în funcție de acest gradient. Cu toate acestea, molecula este încărcată, transportul ei este afectat atât de gradientul de concentrație, cât și de potențialul membranei.

Transport activ este transportul substanțelor dizolvate împotriva unui gradient de concentrație folosind energia ATP. Energia este necesară deoarece materia trebuie să se miște, contrar tendinței sale naturale de a se mișca prin difuzie, în sens invers. Un exemplu este pompa de sodiu-potasiu. Conform legilor difuziei, ionii de Na se deplasează în mod constant în celulă, iar ionii K + ies din celulă. Încălcarea concentrației necesare a acestor ioni duce la moartea celulelor.

Aparatul de suprafață al celulei.

O varietate de celule procariote și eucariote constă din părți: aparat de suprafață, citoplasmă, aparat nuclear.

Aparatură de suprafață celulele îndeplinesc trei funcții care sunt universale pentru toate tipurile de celule: barieră, transport, receptor. De asemenea, poate îndeplini o serie de funcții specifice (de exemplu, funcția de turgescență mecanică a peretelui celular din celulele vegetale). Aparatul de suprafață al celulelor este format din sisteme: membrana plasmatică, complexul supramembranar și aparatul musculo-scheletic submembranar (adică submembrană).

membrana plasmatica, sau plasmalema, este sistemul principal al aparatului de suprafață, universal pentru toate celulele. Sub acesta se află un sistem submembranar, care este implicat în transportul și recepția transmembranară și face parte din citoplasmă.

Structura supramembrana Aparatul de suprafață interacționează între celule și mediul extern sau cu alte celule. În celulele animale, complexul supramembranar sau glicocalix, joacă un rol important în funcția de receptor a celulelor. Glicocalixul este format din carbohidrați și este relativ subțire și elastic.

Aparține structurilor supramembranare derivate peretele celular. Trebuie să fie produs de celulele plantelor, ciupercilor și bacteriilor. Peretele celular al plantelor conține celuloză, ciuperci - chitină, bacterii - mureină. Este destul de rigid și nu se micșorează. Apa, sărurile și moleculele multor substanțe organice trec prin peretele celular. Fenomenul de plasmoliză și deplasmoliză în celulele vegetale.

Plasmoliza- aceasta este separarea citoplasmei de membrană atunci când celula este scufundată în hipertonă, adică. concentrat din exterior, soluție. Dacă celulele animale sunt scufundate într-o soluție hipertonă, acestea se micșorează. Uneori celulele plasmolizate rămân în viață. Dacă astfel de celule sunt scufundate în apă în care concentrația de săruri este mai mică decât în ​​celulă, are loc deplasmoliza.

Deplasmoliza- aceasta este revenirea citoplasmei celulelor vegetale dintr-o stare de plasmoliza la starea initiala.

În timpul unui studiu citologic, structura celulelor este studiată pentru a identifica tumori maligne, benigne și leziuni de natură non-tumorală. Scopul principal al studiului este de a confirma sau infirma faptul de malignitate a celulelor luate pentru analiză.

Metodele de cercetare citologică se bazează pe studierea structurii celulelor, a compoziției celulare a fluidelor și țesuturilor la microscop.

Există următoarele metode de cercetare citologică:

• microscopie ușoară;
• microscopie electronică;
• metoda de centrifugare. Se utilizează atunci când este necesară separarea membranelor celulare de structura generală;
• metoda atomului etichetat. Sunt folosite pentru studiul proceselor biochimice din celule: în acest scop, se introduce în ele un izotop radioactiv marcat;
• studiu pe viață. Această metodă de cercetare face posibilă studierea proceselor dinamice care au loc în celulă.

Concluzia unui studiu citologic se bazează pe caracteristicile modificărilor citoplasmei, nucleului celular, raportului nuclear-citoplasmatic, formării complexelor și structurilor celulare.

Analiza citologică este utilizată în timpul unei examinări preventive, pentru a clarifica diagnosticul, în timpul intervenției chirurgicale, pentru detectarea în timp util a recăderilor și pentru a monitoriza progresul tratamentului.

Examenul citologic al frotiurilor

Pentru analiză se folosesc următoarele materiale:

• lichide: urină, secreții de prostată, spută, tampoane obținute în timpul endoscopiei diferitelor organe, scurgeri din mameloane, amprente și răzuire de pe suprafețe ulcerative și erodate, răni și fistule, lichide din cavitățile seroase și articulare;
• punctate: materiale biologice obținute în timpul unei puncție diagnostică efectuată cu un ac subțire;
• frotiuri din cavitate și col uterin.

Cele mai multe dintre aceste studii citologice ale frotiurilor sunt efectuate dacă este necesar, pentru a stabili și a clarifica diagnosticul. Dar o examinare citologică a unui frotiu de col uterin (test Papanicolau) este recomandată: o dată pe an - pentru femeile cu vârsta peste 19 ani care sunt active sexual; de două ori pe an - pentru femeile care iau contraceptive hormonale și au avut herpes genital; mai mult de două ori pe an - pentru femeile care suferă de infertilitate, sângerări uterine, obezitate, care își schimbă adesea partenerii sexuali, care iau estrogeni, care au negi pe organele genitale și au fost diagnosticate cu herpes genital.

Examenul citologic al colului uterin

Pentru o examinare citologică a colului uterin, se prelevează un frotiu din părțile exterioare și interioare ale colului uterin și din bolta vaginală folosind o spatulă specială din lemn. Apoi se transferă pe sticlă și se fixează.

Se efectuează o examinare citologică a colului uterin pentru a identifica modificările canceroase ale celulelor și, în concluzie, medicul indică una dintre cele cinci etape ale stării celulelor:

• stadiul 1. Nu se găsesc celule cu anomalii;
• stadiul 2. Există modificări minore în structura celulelor cauzate de inflamația organelor genitale interne. Această stare a celulelor nu provoacă îngrijorare, dar femeii i se recomandă să se supună examinării și tratamentului suplimentar;
• stadiul 3. S-au găsit un număr mic de celule cu anomalii de structură. În acest caz, se recomandă efectuarea unui frotiu din nou sau efectuarea unui examen histologic al țesutului modificat;
• stadiul 4. Se găsesc celule individuale cu modificări maligne. Nu se pune un diagnostic final, se prescrie o examinare suplimentară;
• stadiul 5. Un număr mare de celule canceroase se găsesc în frotiu.

Fiabilitatea unui astfel de studiu citologic este mare, dar poate oferi doar informații despre zona din care au fost prelevate celulele pentru analiză. Pentru a evalua starea trompelor uterine, a ovarelor și a uterului, ar trebui să fii supus unei examinări cuprinzătoare.